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由番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,以下简称 Cmm）所导致的番茄溃疡病（Bacterial canker of tomato）,是一种重要的种传细菌性病害,给世界各地的番茄生产带来严重的经济损失。本研究室前期研究结果表明,Cmm在寡营养条件下可进入有活力但不可培养（Viable but non-culturable,以下简称VBNC）状态,处于VBNC状态的Cmm不能在常规培养基上形成菌落,但在适当的条件下可以恢复可培养性和致病性。本论文在前期研究基础上,建立了从番茄种子中通过实时荧光定量PCR检测VBNC状态Cmm的方法,对VBNC状态下Cmm菌体的形态变化、细胞壁肽聚糖的结构和成分进行了深入研究,初步探索了 VBNC状态Cmm菌体发生上述变化的形成机制。主要结果如下:1、实现了对番茄种子携带VBNC状态Cmm的qPCR检测:建立了基于经过改良的叠氮溴化丙锭（PMAxx）染色的实时荧光定量PCR（PMAxx-qPCR）检测Cmm活菌的方法,通过结合平板计数法,可特异性地检测VBNC状态Cmm的数量。选用终浓度为20 μM的PMAxx染料,经避光染色8 min和光照处理10 min后,得出PMAxx-qPCR方法对Cmm活细胞的最佳检测计数范围为 103-107 CFU/ml;对 50μM 硫酸铜诱导 108 CFU/ml Cmm 0、3、24、72、144、240、360、480和720 h的活细胞数量进行检测,所得数据与基于SYTO 9/碘化丙啶（PI）染色的流式细胞术方法检测的结果相一致。对人工接菌以模拟携带VBNC状态Cmm的番茄种子进行检测,可有效区分种子携带的VBNC状态Cmm菌体和死亡状态的菌体。2、观察并明确了 VBNC状态Cmm细胞的外部形态和内部结构特征:借助扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对VBNC状态的Cmm菌体形态和内部结构进行了观察,SEM放大到60,000倍后,可观察到VBNC状态Cmm细胞表面出现凸起和变得粗糙,细胞宽度（492±31 nm）明显大于对数期（385±19 nm）细胞及经过加热处理（364±26 nm）和酒精处理（412 ±14nm）的死亡状态的Cmm细胞。当硫酸铜诱导的时间超过120 h,Cmm菌体表面没有凸起的位置开始出现皱缩,细胞不再呈现典型的短杆棒状特征,而是变为不规则扭曲状。对Cmm细胞横切面放大到50,000倍后,TEM观察到Cmm细胞内部没有被柠檬酸铅（核酸和细胞质染色剂）着色区域的面积随着诱导时间的延长而逐渐扩大,表明细胞内的核酸和蛋白在诱导过程中逐步发生了降解。3、初步明确了铜离子诱导下Cmm肽聚糖合成相关基因的功能:对铜离子诱导的VBNC状态Cmm转录组中差异表达的有关细胞壁合成相关基因进行了验证,分析发现转录组数据中与细胞壁合成相关的6个表达量发生明显变化的基因皆为肽聚糖合成基因;表达量验证结果表明,在10个肽聚糖合成相关的基因中,对肽聚糖合成的重要前体Lipid I起调控作用的mraY基因和调控肽聚糖由细胞膜内转运到膜外的基因murJ显著上调表达。利用穿梭载体pHN216,成功构建mraY和murJ过表达的Cmm转化子,其生长速率低于亲本菌株,但在受铜离子诱导进入VBNC状态的时间上并没有显著的差异。4、系统解析了 VBNC状态Cmm的肽聚糖结构:对VBNC状态Cmm菌体的物理特性研究中发现,VBNC菌体经100℃高温加热后仍保持膜结构的完整性,通过超声破碎测得OD580下降50%所需的时间是对数期和平台期细胞的3倍。建立了快速提取Cmm细胞壁肽聚糖的方法,结合超高效液相色谱质谱联用（UPLC-MS）分析,发现Cmm在铜离子诱导24 h后肽聚糖样本中首次出现了四聚体胞壁肽,且比例随着诱导时间的增加而升高,诱导后胞壁肽单体所占的比例逐渐下降。铜离子诱导使Cmm的肽聚糖交联化程度显著提高,从指数期的38.0%增加到诱导240 h后的52.6%;发生氧乙酰化的胞壁肽所占比例从指数期的23%上升到36.2%。本论文首次针对革兰氏阳性植物病原细菌开展了 VBNC状态下细胞形态和细胞壁结构的相关研究,揭示了细胞结构与抗逆的内在关系,丰富了植物病原细菌抗逆生理的研究内容。