论文部分内容阅读
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, Hps)属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属,是猪上呼吸道的常在菌,该菌引起的感染给养猪生产带来极大的损失。该菌血清型众多,毒力因子复杂,到目前为止发现了一些副猪嗜血杆菌的毒力因子,但针对不同致病力副猪嗜血杆菌分泌蛋白的差异研究报道甚少。本试验选取两株不同致病力副猪嗜血杆菌Nagasaki和SW114菌株作为研究对象,比较其生长特性及致病力,采用蛋白质组学技术比较并鉴定其对数期差异分泌蛋白质,同时利用荧光定量PCR技术分析差异分泌蛋白基因转录水平,具体研究内容如下：1副猪嗜血杆菌Nagasaki和SW114株生长特性和致病力的比较本试验采用比浊法和平板活菌计数两种方法测量了Nagasaki和SW114株的生长曲线,结果得知对数期SW114株生长速度明显快于Nagasaki株,SW114株稳定期持续时间约为9h,长于Nagasaki株的6h,当OD600=0.6时,两菌株都处于对数生长期。以体重20-22g 4-8周龄雌性BALB/c小鼠为试验动物,采用改进寇氏法钡Nagasaki和SW114株的半数致死量,结果Nagasaki株的半数致死量为3.16×109cfu, SW114株的半数致死量为2.95×1012cfu,表明Nagasaki株的致病力约为SW114株的1000倍,从而为进一步进行分泌蛋白质组学分析奠定基础。2副猪嗜血杆菌Nagasaki和SW114株分泌蛋白的比较蛋白质组学分析采用三氯乙酸(TCA)沉淀法分别提取Nagasaki和SWll4株对数期分泌蛋白,采用双向电泳技术(two-dimensional (2D) electrophoresis)分离分泌蛋白样品,结果成功构建了Nagasaki和SW114株37℃C培养条件下的分泌蛋白图谱,经PDQuest8.0软件比较并分析图谱发现Nagasaki株分泌蛋白图谱中有32个蛋白点,SW114菌株分泌蛋白图谱有25个蛋白点,其中两张图谱共有的点有22个,10个蛋白点仅存在于Nagasaki株的分泌蛋白图谱,3个点仅存在于SW114株的分泌蛋白图谱。从双向电泳凝胶中挖取这13个差异蛋白点,经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption /ionization tandem time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF/TOF-MS)鉴定,这13个蛋白点对应12中蛋白,其中10个蛋白仅存在于Nagasaki株的分泌蛋白中,依次为粘附素AidA蛋白、胞外丝氨酸蛋白酶(自转运体)(771aa)、胞外丝氨酸蛋白酶(自转运体)(780aa)、表面保护性抗原D15、30 S核糖体蛋白S2、周质丝氨酸蛋白酶、酸性磷酸酶、外膜蛋白、蛋白-二硫化物异构酶、铁ABC转运体底物结合蛋白。2个蛋白仅存在于SW114株的分泌蛋白中,依次为C4-二羧酸ABC转运体底物结合蛋白、肽ABC转运体底物结合蛋白。经分析发现,差异蛋白粘附素AidA蛋白、胞外丝氨酸蛋白酶(自转运体)(771aa)、胞外丝氨酸蛋白酶(自转运体)(780aa)与毒力相关,差异蛋白C4-二羧酸ABC转运体底物结合蛋白和肽ABC转运体底物结合蛋白与代谢相关。3副猪嗜血杆菌差异分泌蛋白的基因转录水平分析为了探讨差异分泌蛋白的基因转录水平情况,选取其中三个蛋白：粘附素AidA蛋白、表面保护性抗原D15和铁ABC转运体底物结合蛋白,其编码基因依次为Aida、 ompD15和AfuA,通过实时荧光定量PCR方法检测其在Nagasaki口SW114株的转录水平。实验结果显示,Aida基因的转录水平在Nagasaki株是其在SW114株的3.924倍,ompD15基因的转录水平在Nagasaki株是其在SW114株的36.668倍,AfuA基因的转录水平在Nagasaki株是其在SW114株的39.606倍,选取的这三个蛋白的基因转录水平在Nagasaki株均高于SW114株,转录水平和表达水平呈现一致的趋势。粘附素AidA蛋白、胞外丝氨酸蛋白酶(自转运体)(771aa)、胞外丝氨酸蛋白酶(自转运体)(780aa)与毒力相关,C4-二羧酸ABC转运体底物结合蛋白和肽ABC转运体底物结合蛋白与代谢相关,这些发现可能从分子水平解释了Nagasaki株致病力强于SW114株及其对数期生长速度慢于SW114株,同时为该病原致病机理和防制的进一步研究奠定分子基础。