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藏羚羊(Pantholops hodgsonii)隶属偶蹄目、牛科、藏羚属,主要分布在中国青海、新疆和西藏三地高海拔恶劣的生境中。由于藏羚羊绒极高的经济价值,曾遭到灭绝式的捕杀。美国渔业与野生动物保护组织和濒危野生动植物种国际贸易公约组织将其列为濒危和禁止贸易物种。利用现代生物学技术一种间克隆进行人工繁育藏羚羊也是一条新的保护思路。手导式克隆技术是体细胞种间核移植的方法之一。本研究以手导式克隆技术为手段,构建了藏羚羊-山羊、藏羚羊-牦牛、藏羚羊-黄牛、藏羚羊-奶牛的种间克隆胚。主要研究内容、结果和结论如下。
1、建立了藏羚羊耳部皮肤成纤维细胞系,并测定其群体倍增时间为2.08d。
2、比较了卵巢保存温度对绵羊、山羊、牦牛、黄牛和奶牛卵母细胞体外成熟率的影响。保存温度为20℃-25℃、26℃-30℃时,绵羊、山羊、牦牛、黄牛和奶牛卵母细胞成熟率分别为55.71％±2.5%VS43.27%±6%,66.61%±1.2%。VS62.35%±0.7%,67.94%±4.1%VS60.51%±1.8%,85.07%±2.2%VS68.04%±2.3%,69.43%±1.8%VS63.8%±3.40%。实验结果表明,绵羊、山羊、牦牛、黄牛和奶牛的卵巢保存于20℃-25℃时为宜,该卵巢保存温度可提高卵母细胞体外成熟率。
3、以山羊卵母细胞为研究对象,比较3种手动去核方法的效率,并利用荧光染色法测定了山羊卵母细胞去核率。山羊卵母细胞经3种不同方法去核的复圆率分别为71.7%±5.7%、82.27%±5.2%、58.04%±3.5%。方法2获得的山羊卵母细胞复圆率最高。去核处理的山羊卵母细胞用荧光染色法签定的去核率为96%。由于方法2获得的卵母细胞复圆率和去核率较高,因此绵羊、牦牛、黄牛和奶牛的卵母细胞去核均用此方法,复圆率分别为7%、87.79%、67.01%和84.73%。
4、比较了两步法融合、一步法融合和化学辅助法融合藏羚羊皮肤成纤维细胞和牦牛去核卵母细胞的融合效率。两步法融合、一步法融合和化学辅助法的融合率分别为69.42%±6.68%、82.59%±49%和99.00%±1.00%。结果表明化学辅助法为最有效的细胞融合方法,因此减羚羊成纤维细胞与山羊、黄牛和奶牛卵母细胞融合时均采用该方法。藏羚羊成纤维细胞与山羊卵母细胞、黄牛卵母细胞和奶牛卵母细胞的融合率分别为98.25%±1.18%、97.71%±1.66%和93.17%±3.85%。
5、共构建藏羚羊-山羊种间克隆胚118枚,其中克隆胚卵裂率为70.14%,卵裂克隆胚的桑椹胚发育率为100%。减羚羊-牦牛种间克隆胚共构建30枚,克隆胚的卵裂率为80%,卵裂克隆胚有14%停滞在2细胞期,67%发育至4细胞期,29%发育至8细胞期,没有发育至桑椹胚或囊胚阶段的藏羚羊-牦牛克隆胚。构建藏羚羊-奶牛克隆胚110枚,卵裂率为31.06%。卵裂克隆胚7%停滞在2细胞期,53%发育至4细胞期,33%发育至8细胞期,7%发育至桑椹胚。共构建藏羚羊-黄牛种间克隆胚120枚,64.27%卵裂,6%发育停滞于2细胞期66%克隆胚发育至4细胞期,22%发育至8细胞期,6%可发育至桑椹胚。结果表明藏羚羊-山羊种间重构胚体外发育较好,可用于胚胎移植。