论文部分内容阅读
自2008年以来猕猴桃细菌性溃疡病在世界各地的猕猴桃主产区相继大面积爆发，溃疡病引起了世界猕猴桃产量的逐年下降，因此猕猴桃细菌性溃疡病是猕猴桃产业面临的一个巨大的威胁。猕猴桃细菌性溃疡病由丁香假单胞菌属猕猴桃变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae，Psa)的侵染引起，但是猕猴桃与Psa之间的互作机制研究较少。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)参与调控多个生物进程并形成复杂的调控网络，但是猕猴桃中lncRNA的系统全面鉴定及lncRNA在猕猴桃与Psa互作过程中发挥的潜在功能仍然未知。与lncRNA一样，环状RNA(circle RNA，circRNA)同样具有重要的功能，但是猕猴桃中circRNA的鉴定、基本特征及其在猕猴桃与Psa互作过程中的功能的报道较少。我国及世界猕猴桃产业发展面临诸多问题与困境，除了溃疡病害外，如何快速的进行种质创新是猕猴桃遗传育种与产业发展急需解决的另外一个重要问题。最近基于the clustered regulatory interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein(CRISPR/Cas)系统开发出来的位点特异基因组编辑技术被广泛用于作物遗传改良和基因功能研究中，但在猕猴桃中还没有关于猕猴桃位点特异的基因组编辑体系报道。本论文以研究猕猴桃与Psa互作过程中转录水平的响应机制及两种非编码RNA(lncRNA和circRNA)的潜在功能为目的，同时研究建立适合猕猴桃的高效快速的基因编辑体系，主要研究结果如下: 基于不同侵染阶段的不同猕猴桃物种的转录组测序，我们一共鉴定到来源于12，280基因组位点的14，845个lncRNA。对差异表达的转录本进行聚类分析表明蛋白质编码转录本和lncRNA转录本均呈现高度的物种特异性表达模式，而不同猕猴桃物种的差异表达主要集中在病原物相关分子模式触发的免疫反应(pattern-triggered immunity,PTI)，这说明不同猕猴桃物种对于Psa的侵染表现出差异的响应模式。基于加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)，我们鉴定出多个与猕猴桃免疫应答相关的物种特异的关键lncRNA。 基于前述转录组数据，我们进一步鉴定到3，582个circRNA，其中64.01％、21.44％和14.55％的circRNA分别为基因间circRNA、外显子circRNA和内含子circRNA。我们发现circRNA的表达模式在猕猴桃中呈现高度的组织特异性和物种特异性。我们发现外显子和内含子circRNA与其亲本基因的表达呈现显著的正相关，而且内含子circRNA的正相关趋势更加显著。基于加权基因共表达网络分析，我们鉴定出多个与猕猴桃免疫应答相关的物种特异的关键circRNA。 针对猕猴桃八氢番茄红素去饱和酶基因(phytoene desaturase，AcPDS)设计了四个靶点synthetic guide RNA(sgRNA)。我们提出一种快速高效的配对sgRNA/Cas9双元表达载体的构建策略并构建了针对猕猴桃AcPDS基因的配对sgRNA/Cas9双元表达载体。我们比较了含有不同sgRNA表达盒类型的双元载体在猕猴桃中的基因编辑效率，表达盒包括tRNA-sgRNA多顺反子表达盒(the polycistronic tRNA-sgRNA cassette，PTG)和传统的sgRNA表达盒(the traditional CRISPR expression cassette，CRISPR)。我们发现在猕猴桃中PTG/Cas9系统的编辑效率是CRISPR/Cas9系统的10倍左右，这个结果与不同sgRNA表达盒中sgRNA的表达丰度一致。我们同时发现PTG/Cas9系统中的配对sgRNA可以引起猕猴桃基因组的大片段删除。针对猕猴桃AcPDS基因的基因编辑可以诱发猕猴桃的白化表型。与CRISPR/Cas9系统相比，PTG/Cas9系统更加适合于猕猴桃的高效基因组编辑。