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ZNRF3(zinc and ring finger 3)是一种包含RING结构域的跨膜蛋白,其可以作为跨膜E3泛素连接酶调控Wnt/β-catenin信号通路中两个重要的膜蛋白受体Frizzled和LRP6的泛素化降解过程,进而发挥抑制Wnt/β-catenin信号通路的生物学作用。但是究竟存在哪些分子在ZNRF3的上游对其进行蛋白表达水平的调控并影响Wnt/β-catenin通路下游基因的表达及功能到目前为止还不明确。同时,有研究显示ZNRF3可以在多种肿瘤中发挥抑癌基因的生物学作用,但是其在癌症的发生发展和恶性转化中所发挥的生物学功能至今尚不十分清楚。为了揭示ZNRF3在癌症中发挥的生物学功能及其蛋白表达的调控机制,本研究对多种肿瘤细胞进行蛋白表达检测发现在DLD1和U2OS细胞中ZNRF3呈现低表达,而HCT116和HeLa细胞中ZNRF3呈现高表达。因此,我们利用在DLD1和U2OS过表达ZNRF3检测细胞增殖、克隆形成、迁移等实验证实了ZNRF3具有抑制肿瘤细胞的增殖和运动能力的生物学特性。同时,对高表达ZNRF3的细胞系进行敲减实验检测上述表型,发现与过表达实验结果具有一致性。利用Western blot实验检测发现,过表达ZNRF3可以导致细胞周期进程和EMT过程被抑制,同时促进了细胞凋亡。这些结果表明ZNRF3在癌症中发挥抑癌作用的机制是抑制肿瘤细胞的细胞周期进程和EMT,影响细胞增殖及侵袭与迁移,并通过促进凋亡控制肿瘤生长。利用蛋白酶体抑制剂MG132和Cullin家族蛋白特异性抑制剂MLN4924处理细胞,证实了ZNRF3可通过泛素-蛋白酶体途径进行降解,而且其蛋白水平受到SCF E3连接酶复合体的调控。进一步研究利用Co-IP实验,证实了ZNRF3与SCF复合体中的Cullin1、Rbx1和Skp1蛋白均呈特异性结合。当Cullin1敲减后,ZNRF3表达量上升并且半衰期延长。这一结果提示Cullin1可以在ZNRF3的上游调控其蛋白稳定性。进而研究利用His Pull-down实验证实ZNRF3的泛素化修饰类型为K27和K63。鉴于F-box蛋白在SCF复合体与底物的结合过程中起到关键作用,本研究利用一系列的F-box蛋白重组体与ZNRF3进行结合实验,发现β-TRCP1与ZNRF3可以特异性结合。利用体外降解实验证实ZNRF3可被β-TRCP1降解,并且此过程可以被回复。在敲减β-TRCP1后,ZNRF3的表达量和半衰期都显著的上升,同时β-TRCP1可以使ZNRF3的泛素化水平增强。通过以上实验可以确认β-TRCP1作为SCF复合体中的F-box蛋白可以在上游与ZNRF3直接结合并且是调控ZNRF3泛素化降解的关键分子。在敲减β-TRCP或者加入CKI抑制剂时,Wnt/β-catenin的下游信号受到了抑制,进一步证实了ZNRF3是β-TRCP的底物分子。由于β-TRCP1作为SCF E3泛素连接酶复合体中直接与底物蛋白结合的组分,通常倾向于识别底物分子内部一段保守的降解决定子序列,其特征为D-pS-G-X-XpS。此序列中的丝氨酸需要进一步被磷酸化修饰以便于β-TRCP1对其识别。因此,为了明确β-TRCP1对ZNRF3的识别是否也是通过磷酸化依赖的泛素化形式来实现的,本研究利用去磷酸化酶处理,激酶降解实验和敲减激酶表达的实验,证实了在ZNRF3上游发挥磷酸化作用的分子是CKIδ。利用多序列比对和降解决定子突变体结合实验等,确认了ZNRF3的降解决定子为SSGQCHCS。同时发现在降解决定子突变后,ZNRF3对Wnt/β-catenin信号通路的负调控作用增强。综上所述,本文初步解释了在Wnt/β-catenin信号通路中发挥重要调控作用的ZNRF3蛋白在癌症中发挥抑癌作用的生物学机制。并且阐明了其泛素化降解机制,证实Skp1-Cullin1-β-TRCP1蛋白复合体是在ZNRF3的上游与其结合并催化其泛素化的关键蛋白,其发挥降解作用的方式是通过识别磷酸化修饰的降解决定子来实现的。完善了对β-TRCP1调控Wnt/β-catenin的认识,即在Wnt off的状态下,β-TRCP1可以通过降解β-catenin的方式负调控Wnt通路;而在Wnt on的状态下,β-TRCP1可以通过降解ZNRF3的方式正调控Wnt通路。