盐芥氧化还原相关基因DHAR和Fe-SOD的功能研究

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盐芥—拟南芥的近亲,具有非常强的耐盐能力,能够耐受500mM氯化钠的冲击。分析植物的耐盐机理大致可以分为一下四类:一是泌盐,如中华补血草,其通过特殊的生理结构一盐腺,将体内多余的盐分分泌排出体外,以维持体内低盐环境;二是离子区域化,如盐地碱蓬,其肉质化的叶和茎意味着细胞中液泡将细胞质中的盐离子大量泵入液泡内以维持细胞质的离子稳态:三是超强的抗氧化能力,细胞内离子浓度的异常增高通常会引起活性氧的增加,活性氧的活跃会危害生物大分子如蛋白质,核酸的功能,植物细胞通过积累大量的还原性物质如抗坏血酸,以中和活性氧,或者通过酶促反应清除活性氧,减少活性氧对细胞的危害,主要的酶包括各类CAT,POD,SOD,MDAR等;四是渗透保护物质,如脯氨酸,甜菜碱等小分子有机物质,它们可减少细胞因胞内高离子浓度引起的细胞失水而保护细胞。 盐芥由于不具备形态学上的特殊结构——盐腺和肉质化的茎叶,而不能通过泌盐和离子区域化抗盐。所以我们推测其较强的抗盐能力是源于其超强的抗氧化能力和迅速积累渗透保护物质的能力。在此,我们主要从抗氧化能力的角度去研究探讨盐芥的耐盐机理。 本论文的思路如下:找出最为活跃的活性氧清除酶类,用RNAi的方法将其knockdown,以观察植物耐盐能力的变化。所以我们实验的第一步是找到我们研究的靶基因,我们从Genbank中找到盐芥基因的EST,从中筛选出活性氧清除酶类,设计引物,分别以正常生长条件下的盐芥和盐处理的盐芥的RNA为模板进行Realtime PCR,以期找到盐处理前后转录变化最大的基因。令我们失望的是我们选取的各基因对盐处理的反应方向和变化幅度都非常接近。所以,我们挑选了变化幅度最大的DHAR和FeSOD作为我们接下来的研究对象。我们从这两个基因的EST序列中选取大约300bp作为沉默的靶向序列。将沉默表达载体导入农杆菌后通过点花浸染盐芥。经除草剂筛选后先用PCR的方法进行分子鉴定,以确认转基因成功。再用Northem bolting的方法检测沉默的效果,待确认靶向基因被沉默以后检测植株的耐盐能力与野生型相比有无变化,有多大程度的变化,从而得出盐芥活性氧清除系统对其抗盐能力贡献大小的初步结论。由于植物的抗氧化系统比较复杂:机理分酶促和非酶促两种,酶促机制中的功能分子多种多样:有CAT、POD、SOD、DHAR、MDAR五大类,而SOD又可以根据其金属辅基的不同分为Cu—ZnSOD、FeSOD、MnSOD。所以单个基因的沉默并不能引起植物抗氧化能力在很大程度上的改变,这从我们的实验中可以看出:DHAR和FeSOD的沉默没有引起盐芥耐盐能力的明显改变,这反映了植物在抗氧化方面存在冗余机制以补偿失去的部分。
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