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雪地茶(Thamnolia subuliformis(Ehrh.) W.Culb.)系地茶科地茶属植物，主产区四川、西藏和云南。味淡微苦，凉，无毒，具清热解毒，安神养心，明目等功效，民间常以水煎服或泡茶饮，治疗咽喉肿痛，腹痛，消化不良，中暑，心中烦躁，阴虚潮热，肺热咳嗽，神经衰弱，高血压等症，具有较好的临床疗效。本课题对雪地茶中所含有效成分松萝酸口服高生物利用度制剂进行研究，内容包括对雪地茶有效成分的初步研究分离活性单体成分松萝酸；建立雪地茶中松萝酸的含量测定方法；以松萝酸为考察指标，对松萝酸的提取纯化工艺进行优化；以松萝酸为原料，根据其理化性质和临床用药需求，研究制备松萝酸口服自微乳制剂和松萝酸滴丸剂，并进行制备工艺研究和质量评价、动物体内的药动学研究；探讨松萝酸高生物利用度制剂的作用机理等，以期为疗效确切、毒副作用小、生物利用度高的新型抗炎抗菌药物制剂的开发研究提供实验研究基础。
1.对雪地茶进行有效单体成分研究，通过核磁共振波谱数据和相关文献数据对比对compound A进行鉴定，确定为松萝酸。松萝酸为雪地茶中首次发现。通过对松萝酸进行抗炎实验研究和查阅国内外松萝酸药理活性相关文献资料确定松萝酸为雪地茶中活性单体成分。
2.建立雪地茶中松萝酸的HPLC含量测定方法，标准曲线的回归方程为Y=55368888.8034X-34476.6480，r=0.9998，松萝酸在5.02-309.6μg范围内呈良好的线性关系。精密度试验结果的RSD=0.72％，稳定性试验结果的RSD=1.35％，重复性试验结果的RSD=1.01％，加样回收试验结果80％，100％，120％3个目标浓度的回收率分别为95.98％，96.37％和100.3％。该测定方法可靠，简便易行。测定5批四川康定产区雪地茶药材，松萝酸的含量在0.74％-0.91％之间。
3.根据雪地茶药材性质的特点和所选指标成分的性质，同时考虑工业大生产的要求，以松萝酸含量和干膏得率为指标，用活动水平的正交设计对雪地茶的提取工艺条件进行优选，得到两个指标均较好的提取工艺条件为，80％乙醇回流提取2次，第一次12倍量3h，第二次12倍量1.5 h，验证试验证明方法可行。松萝酸的纯化工艺研究，得到较优纯化工艺条件为，醇提物用氯仿萃取至薄层检查无松萝酸斑点，合并氯仿萃取液，减压回收溶剂，得氯仿萃取物，经硅胶柱色谱层析，用石油醚-乙酸乙酯(20:1-1:1)系统进行梯度洗脱，薄层检查，合并含有松萝酸馏分，得到黄色片状粗晶体，粗晶体用氯仿乙酸乙酯混合溶剂反复重结晶得到松萝酸淡黄色针状晶体(HPLC测定含量≥98％)。将得到的松萝酸作为原料药，进行制剂研究。
4.松萝酸原料药的理化性质考察及初步稳定性评价。结果表明，松萝酸属难溶性药物，其油水分配系数Log P=2.936；松萝酸在强碱、强酸条件下较稳定，无明显降解产物产生；在高温(100℃，以水为介质)、强光和氧化条件下不稳定，有降解产物产生，且降解产物的色谱峰与松萝酸的色谱峰有较好分离。初步稳定性考察显示，露置空气试验、高温试验(60℃)、高湿试验(75％和92.5％)等结果表明，药物在固体状态下具有较好稳定性。依据以上性质进行剂型设计，拟制备松萝酸自微乳制剂和滴丸剂两种高生物利用度剂型。
5.制备松萝酸自微乳制剂，以提高松萝酸的口服吸收。建立松萝酸自微乳制剂的高效液相色谱体外分析方法，标准曲线的回归方程为Y=7E+07X-11667，r=1，松萝酸在1.97-126.00μg范围内呈良好的线性关系。精密度试验结果的RSD=0.13％，稳定性试验结果的RSD=0.90％，重复性试验结果的RSD=0.54％，加样回收试验结果80％，100％，120％3个目标浓度的回收率分别为100.34％，100.37％和99.77％。测得自微乳中松萝酸含量为4.55 mg·g-1。该测定方法可靠，简便易行。在处方前研究中，考察松萝酸在不同油、表面活性剂和助表面活性剂中的平衡溶解度；绘制伪三元相图，评价处方中各组成对微乳形成的影响。在前两者的基础上，选择适宜的油相、表面活性剂和助表面活性剂，即以LabrafacLipophile WL1349: Maisine35-1(1:1)作为混合油相，Cremophor RH40作为表面活性剂，Transcutol P为助表面活性剂，制备松萝酸自微乳制剂。以表面活性剂和助表面活性剂的比例Km和油相重量百分比作为考察因素，以自乳化时间、透光率、药物平衡溶解度、昙点、电导率、5 min和60 min时药物的累积溶出量作为因变量，采用星点设计-效应面法优化松萝酸自微乳化给药系统的处方，最终确定松萝酸自微乳制剂最优处方组成为，油相:乳化剂:助乳化剂=25％:50％:25％。松萝酸自微乳制剂的粒径测定结果表明，粒径在30-40 nm，呈正态分布；透射电镜观察其形态，结果表明，加水稀释后能形成较为均一的圆球形乳滴。初步稳定性考察表明，高温(60℃)、光照(4000±500 Lx)对松萝酸自微乳制剂的外观和含量影响较大，制剂颜色加深，药物成分的含量降低，有明显降解物质产生。留样观察结果表明，在室温条件下，6个月内松萝酸自微乳制剂的外观和含量变化均符合要求。松萝酸抗菌实验结果显示，松萝酸原料药和自微乳制剂对ATCC25923、WHO-2和肺炎球菌的生长有抑制作用，MIC分别为6.2μg·mL-1、12.5μg·mL-1、12.5μg·mL-1，对绿脓杆菌和大肠杆菌无效。抗炎实验考察了松萝酸原料药及自微乳制剂对腹腔巨噬细胞的细胞毒作用(MTT法)，结果表明，各处理组细胞量与培养基组相比较，均无统计学差异，说明松萝酸原料药及自微乳制剂在1-100μg·mL-1浓度范围内对小鼠腹腔巨噬细胞无显著细胞毒作用。对热灭活大肠杆菌诱导小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的影响实验显示，单纯热灭活大肠杆菌组TNF-α的水平显著升高，提前2小时用不同浓度的原料药和自微乳制剂作用于细胞，TNF-α的水平均有不同程度的下降，并呈一定的量效关系；终浓度为0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg·mL-1的松萝酸原料药预处理可使热灭活大肠杆菌诱导的TNF-α释放抑制达13.3％、46.4％、51.3％、81.0％和83.4％；终浓度为0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg·mL-1的自微乳制剂预处理可使热灭活大肠杆菌诱导的TNF-α释放抑制达4.5％、73.5％、84.5％、86.7％和87.1％。结果表明，松萝酸原料药和自微乳制剂都显示较强的抗炎效应，其中制剂作用更为明显，抗炎效应明确。
6.采用固体分散技术制备松萝酸滴丸剂。采用均匀设计法，以圆整度和重量差异为指标，对滴丸的制备工艺条件进行优选，得到优化条件为，药物:基质=30 mg:1g，PEG(6000:4000)=0:100，料温70℃，滴距3 cm。验证试验表明方法可行。采用高效液相色谱法建立松萝酸滴丸的含量测定方法，标准曲线的回归方程为Y=7E+07X-11667，r=1，松萝酸在1.97-126.00μg范围内呈良好的线性关系。精密度试验结果的RSD=2.35％，稳定性试验结果的RSD=0.44％，重复性试验结果的RSD=2.51％，加样回收试验结果60％，100％，140％3个目标浓度的回收率分别为99.36％，96.86％和97.65％，测得滴丸中松萝酸含量为2.81％。该测定方法简便可行。采用IR光谱法研究药物在滴丸中的分散状态，IR光谱图谱表明松萝酸以超细结晶状态均匀分散于载体中。进行松萝酸滴丸的体外溶出度研究，结果表明，在含2％ Tween-80的介质中，累积溶出度较好。松萝酸滴丸的初步稳定性考察表明，高温(40℃)、光照(4000±500 Lx)对松萝酸滴丸的外观和含量影响不大，相对湿度(RH75％、RH92.5％)对滴丸的吸湿性影响较大。留样观察结果表明，室温放置6个月内，滴丸的外观和药物成分含量变化均符合要求。
7.松萝酸自微乳制剂和松萝酸滴丸剂的动物体内药动学研究。建立松萝酸血浆样品高效液相色谱分析方法，标准曲线的回归方程为Y=55474X+4166.2，r=0.9994，松萝酸在0.005-50μg范围内呈良好的线性关系。血浆样品稳定性、方法精密度、方法回收率符合要求。结果提示，对照组和各制剂组在大鼠体内给药后均符合单室一级吸收模型。以24 mg·kg-1的剂量灌胃分别给予大鼠松萝酸混悬液、松萝酸自微乳制剂和松萝酸滴丸，Tmax分别为2.350 h、2.968 h和3.125 h，Cmax分别为12.431μg·mL-1、36.860μg·mL-1和42.392μg·mL-1； AUC分别为129.783μg·mL-1·h、660.934μg·mL-1·h和646.777μg·mL-1·h。松萝酸滴丸和松萝酸自微乳制剂的达峰时间(Tmax)和混悬液剂差异不大，达峰浓度(Cmax)均显著高于混悬液剂，两种制剂的药-时曲线下面积(AUC)明显大于混悬液剂；松萝酸自微乳制剂和松萝酸滴丸的消除半衰期t1/2(ke)明显延长。和对照组混悬液比较，松萝酸自微乳制剂与松萝酸滴丸的相对生物利用度分别为509.3％，498.4％，两种制剂的相对生物利用度均显著提高。