氨基酰化酶发酵工艺及丙氨酸拆分研究

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本文对产氨基酰化酶的菌株进行了广泛筛选并进行液体发酵培养研究,考察了不同菌株在液体培养基中菌体产量及氨基酰化酶在菌体细胞内外分布情况和酶活力。筛选出一种产氨基酰化酶的高产菌株即刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)9980。该菌株生长快,发酵时间短,酶活高。 分别选取二种液体发酵培养基—察氏培养基、豆汁培养基以及蛋白胨培养基培养刺孢小克银汉霉,并对其进行液体发酵培养。初步研究了刺孢小克银汉霉在液体培养条件下的生长特点及酶活时间进程。结果表明:菌株在察氏培养基中生长缓慢,菌球致密,酶活较低,发酵时间长,发酵周期60小时,其菌体细胞比酶活最高为293tU/g;而蛋白胨培养基中菌体生长最快,发酵时间最短,36小时菌体细胞的比酶活达到415U/g。 对上述产氨基酰化酶活性较高的蛋白胨培养基进行单因子实验条件的优化,并对影响菌体酶活力较大的四个因素进行正交实验。结果表明,经过优化的蛋白胨培养基为:2%麸皮为碳源,3%蛋白胨和玉米浆混合物(3:1)为氮源,lOmg/L维生素B〈2〉,Tweer-80为0.05%(体积分数),0.2%磷酸氢二钾。经过优化组合后其菌体氨基酰化酶的比酶活达到918U/g。 采用优化的蛋白胨培养基进行刺孢小克银汉霉液体发酵培养,研究了不同发酵条件对菌体牛长及酶活的影响,最适发酵培养条件是:培养温度28℃,pH7.0,接种量为5~8%,250m1三角瓶培养基装量为l00ml,振荡速率130r/min。 考察了不同拆分反应条件对菌体酶活的影响,重点研究了温度、pH、底物浓度、磷酸缓冲液浓度及金属离子与菌体酶活的关系。结果表明:菌体酶活最适温度为55℃,pH为7.0,最佳底物浓度为0.2mo/L。不同缓冲液浓度对菌体酶活均有明显的抑制作用。以水代替磷酸缓冲液时,菌体氨基酰化酶的酶活力最高。低浓度Co〈2+〉对酶活有明显的激活作用,菌体酶活最适Co〈2+〉浓度范围在]0〈-3〉~10〈-4〉mol/L之间,当Co〈2+〉浓度低于10〈-3〉mol/L时几乎没有激活作用,而当浓度高于10<-2>mol/L时明显抑制作用。其他金属离了如不同浓度的Zn<2+>、Cu<2+>、Fe<2+>和Mn<2+>对拆分反应均出现不同程度的抑制作用,其中尤以Cu<2+>和Mn<2+>的抑制作用更为明显。 本文对DL-丙氨酸拆分工艺条件如温度、pH、底物浓度、磷酸缓冲液浓度、激活剂以及拆分反应时间等因素进行考察。其结果表明,最佳拆分工艺条件为:温度50℃、pH7.0和0.2mol/L N-乙酰-DL-丙氨酸,底物溶液中添加5×10<-4>mol/L CO<2+>,拆分反应时间为36小时。 采用刺孢小克银汉霉氨基酰化酶拆分DL-丙氨酸时,产酶发酵时间比米曲霉短,拆分效率高,可达到92.8%。拆分液经分离纯化得到D-丙氨酸,比旋光[α]<20><,D>=13.9~-14.8(C=2,5mol/L HCl),与文献值一致,达到光学纯。
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