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基因怎样控制哺乳动物胚胎的生长和分化是一个非常热门的课题。小鼠作为哺乳动物的研究模型具有诸多优点。小鼠的遗传和生理特点与其它哺乳动物相似,并且它抗感染力强,仔鼠大而世代周期相对较短。从人类对动物了解的遗传信息的资料积累上看,小鼠的遗传信息资料是所有哺乳动物中最为丰富的一个。最为典型的就是小鼠基因组测序基本完成,其覆盖率已超过了小鼠基因组的96%。还有小鼠被广泛的用于疾病模型研究。
自从对小鼠胚胎的发育进行研究以来,大部分进行的都是形态学和细胞学的研究。在DNA双螺旋结构被揭示以后,分子生物学的方法在胚胎学中的应用使得对胚胎发育的研究取得了巨大的进步。尽管如此,胚胎发育的调控是复杂而精巧的,仍有很多的未知事件讫待发现。囊胚的形成在脊椎动物胚胎发育过程中是一关键环节,胚胎的第一次分化就发生在囊胚-是细胞多能性和分化的一个转折点。此时,涉及到一系列的基因的活动,包括Oct4、Stat3和nanog,以及诸多与基因组甲基化直接或间接相关的基因。在寻找与细胞多潜能和分化相关基因的研究中,很多实验以胚胎干细胞为研究材料。然而已有报道显示这种体外培养的细胞并不能完全代表自然状态下细胞的特性。囊胚作为胚胎干细胞的来源,与细胞多能性关系密切。原肠胚作为发育过程中的第二个关键的转折点,涉及到三个胚层的形成和细胞命运决定等多种变化,此时期的细胞正由原来的多潜能逐渐向寡潜能发展,控制分化和成体器官形态建成的基因正逐渐开启。这两个时期特异的新基因的发现和功能研究,将为丰富和完善胚胎发育的基因信息网络提供新数据。因此我们期望以这两个时期胚胎为原始材料,找出与多潜能和控制分化相关的新基因。
本论文以3.5dpc小鼠囊胚为分离多潜能或控制分化相关的新基因的材料(Tester),以6.5dpc原肠胚为扣除材料(Driver),通过基于PCR的减法杂交构建了差减cDNApool。通过点杂交和PCR筛选,获得mED1和mED2两基因的片断,并克隆到了两基因的全长cDNA。然后对两基因分别进行了RT-PCR-Southern、原位杂交、亚细胞定位、反义RNA抑制等实验和生物信息学分析,从而对两基因有了初步认识。
RT-PCR-Southern和原位杂交实验表明,两基因在小鼠胚胎发育阶段,从0.5dpc到12.5dpc的总体表达趋势呈逐渐升高趋势。随着发育的进行,其表达逐渐呈现出空间差异性。在成体组织中,mED1在心脏中呈现高表达,而mED2在肌肉中呈现高表达;并且mED1的在各个组织器官里的表达都高于mED2。两者在各组织器官之间的表达量的差异可能与各组织器官功能相关。
反义RNA抑制实验显示,注射了两基因反义RNA的受精卵与空白对照组相比发育到正常状态1的比率基本都偏低,并且随着发育时间的推移和注射剂量的提高,发育到正常状态的比率也都逐渐走低。注射了100copies反义RNA的胚胎与注射了1000copies反义RNA的胚胎相比,前者的抑制效应开始呈现的时间相对滞后于后者。两基因的反义RNA对早期胚胎发育的抑制作用在总体趋势上的相似性可能提示这两个基因在早期胚胎发育中作用的协调性;而这两基因不同浓度反义RNA的抑制效果走势的差异性又显示出核蛋白基因和细胞质蛋白基因作用的个性特点。
生物信息学分析结果显示,未检索到与这两个基因序列完全同源的基因的功能报道,可以认为mED1和mED2是两个功能未知的基因。mED1可能是一个二分型核蛋白基因,其产物可能参与形成部分拼接体(spliceosome),从而参与mRNA的拼接、成熟等过程。mED2可能为内质网或高尔基体上一跨膜蛋白的基因,其产物可能对新合成出的蛋白进行后期修饰,如折叠及行使分子伴侣的作用等功能。
综上所述,mED1和mED2是两个可能通过参与RNA拼接和蛋白质后加工的方式参与小鼠胚胎发育的新基因。这两个基因在胚胎早期就参与小鼠的胚胎发育;在胚胎发育过程中这两个基因并未显现发育阶段的依赖性,而在成体阶段则显现出可能与功能相关的空间差异性。
发育到正常状态1;指胚胎在某时间发育到该时间应当所到达的状态。如到1.5dpc,胚胎应该为2细胞;到2.5dpc胚胎应该为8细胞;到3.5dpc胚胎应该为囊胚。