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目的:探讨乏氧/辐射双诱导pHRE/Egr-1-Dbait基因对乏氧A549细胞放射敏感性的影响及其作用机制。
方法:取对数生长期的A549细胞,将其分为四组:空白组、Dbait组、Egr-1-Dbait组和HRE/Egr-1-Dbait组,分别与绿色荧光蛋白(GFP)标记的质粒(pcDNA3.1/GFP、pcDNA3.1/GFP-Dbait、pcDNA3.1/GFP-Egr-1-Dbait、pcDNA3.1/GFP-HRE/Egr-1-Dbait)共转染4h,每组按给氧浓度(常氧;5％氧和2.5％氧)分成三个亚组,培养24h,单次照射10Gy后,继续培养12h。RT-PCR检测各组转染细胞中基因表达情况;流式细胞术检测细胞凋亡;单细胞凝胶电泳实验检测细胞尾DNA比例;细胞克隆形成实验,拟合细胞存活曲线,根据相关参数值(D0、Dq、N值、SF2、SER)检测pHRE/Egr-1-Dbait基因在乏氧条件下对A549细胞放射敏感性的影响。
结果:
1、各组转染细胞,经RT-PCR检测结果显示:Dbait组、Egr-1-Dbait组、HRE/Egr-1-Dbait组分别出现32bp、482bp、780bp的条带。
2、流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示:在非照射时,氧浓度对各组细胞的凋亡率无明显的影响;当给予10Gy照射后,各质粒转染组细胞凋亡率在常氧及乏氧条件下与空白组相比,差异均有统计学意义;分析空白组、Dbait组、Egr-1-Dbait组细胞凋亡率,常氧状态下高于乏氧(5％、2.5％)条件下,而乏氧(5％、2.5％)组之间凋亡率均无统计学差异;HRE/Egr-1-Dbait组,乏氧(5％、2.5％)条件下的凋亡率分别为(44.02±1.83、38.02±3.21)高于常氧组(28.65±1.18),乏氧组之间凋亡率有亦有统计学差异。进一步分层分析发现,Egr-1-Dbait组在常氧、氧浓度5％、2.5％乏氧下凋亡率高于相应Dbait组;HRE/Egr-1-Dbait组在氧浓度5％、2.5％乏氧下凋亡率高于相应Egr-1-Dbait组,而在常氧下两组之间的凋亡率无差异。
3、单细胞凝胶电泳实验检测细胞尾DNA比例显示:在非照射时,氧浓度对各组细胞尾DNA比例无明显影响;当给予10Gy照射后,各质粒转染组细胞尾DNA比例,无论是常氧及乏氧条件下,与空白组相比,均有统计学差异;组内比较发现,前三组(空白组、Dbait组、Egr-1-Dbait组)在常氧状态下,细胞尾DNA比例高于乏氧(5％、2.5％)条件下,而乏氧(5％、2.5％)条件下,各组间尾DNA比例均无统计学差异,乏氧(5％、2.5％)时HRE/Egr-1-Dbait组细胞尾DNA比例高于常氧时,进一步分析显示氧浓度2.5％时细胞尾DNA比例高于氧浓度5％时;常氧下,HRE/Egr-1-Dbait组细胞尾DNA比例为22.29±1.13与Egr-1-Dbait(21.53±1.47)相比,差异无统计学意义;而在乏氧(5％、2.5％)条件下,HRE/Egr-1-Dbait组(25.76±1.09、34.66±2.51)与Egr-1-Dbait组(18.73±1.52、17.58±1.18)相比,差异均有统计学意义。
4、细胞克隆形成实验结果显示:氧浓度2.5％乏氧条件下,Dbait组、Egr-1-Dbait组、HRE/Egr-1-Dbait组的SF2分别为0.624、0.589、0.512;增敏比(SER)分别为1.56、1.90、2.17。
结论:Dbait基因本身对A549细胞的凋亡率无明显影响,但在常氧条件下具有明显的放射增敏作用;HRE/Egr-1作为乏氧/辐射双诱导基因,在乏氧(2.5％)/辐射条件下能显著增强Dbait基因的辐射增敏作用。