论文部分内容阅读
研究背景： 博尔纳病病毒(Borna Disease Virus，BDV)是一种非细胞溶解性、高度嗜神经的单股负链RNA病毒，在大多数哺乳动物的中枢神经系统中形成慢性持续感染。多数动物感染BDV后出现轻微的神经症状，形成慢性持续感染，也可表现为急性致死性脑炎，出现精神及行为改变等各种各样的临床表现。近年来有大量的流行病学调查显示BDV慢性持续感染可能与神经精神疾病发生有关，但是BDV究竟是不是神经精神疾病的直接致病因素还有待进一步深入研究。 当前研究BDV致病机制最常用的动物模型就是利用BDV病毒感染新生大鼠，造成新生大鼠慢性持续感染。新生大鼠感染病毒以后被称作新生博尔纳病(neonatal Borna disease,NBD)。新生大鼠感染BDV后会出现各种细胞因子及神经营养因子的改变，还可导致胶质细胞的增生，但由于新生大鼠未发育完善的免疫系统，脑内BDV注射会造成病毒的慢性持续感染，不伴强烈的免疫反应。 目前研究证明BDV感染不会出现细胞的溶解破坏。新生大鼠BDV感染后会出现少量神经元丢失，同时伴有学习记忆障碍，但致病机制尚不完全清楚。 学习和记忆的神经生物学基础是突触可塑性。兴奋性突触执行学习记忆的主要功能。谷氨酸是大脑中含量最多的兴奋性突触递质，因此谷氨酸受体与学习记忆的关系尤其值得我们关注。本课题组前期研究发现新生大鼠BDV感染后学习记忆受损，但其作用机制尚不清楚，需要利用新的技术方法深入研究。 脑片膜片钳技术为学习记忆研究提供了一个强有力的手段，为研究中枢神经系统离子通道或受体在神经环路中的生理和药理学作用及其机制提供了可能性。 目的： 本课题通过建立新生大鼠慢性持续感染动物模型，并在体注射谷氨酸受体激动剂、拮抗剂进行药物干预，观察大鼠行为学的变化；采用western blot技术、免疫组化技术、脑片膜片钳技术观察大鼠海马谷氨酸受体通道的变化；探讨谷氨酸受体在BDV感染致大鼠学习记忆受损过程中发挥的作用，了解新生大鼠BDV感染致学习记忆受损的突触后机制。 方法： 1.利用BDV Hu-H1病毒株长期感染的OL细胞制备病毒液，脑内接种各实验组新生大鼠（24小时内），药物干预组持续2周分别腹腔注射谷氨酸受体激动剂（NMDA、AMPA）、拮抗剂（MK801、CNQX），对照组以PBS代替。大鼠感染6周后进行Morris水迷宫行为学测试。行为学测试完成后取大鼠海马对感染建模是否成功进行鉴定。 2.大鼠行为学测试完成后，取各组实验大鼠海马进行脑片膜片钳实验，观察各实验组海马基本膜电特性及突触后电流变化。 3.大鼠行为学测试完成后，取各组实验大鼠海马进行免疫组织化学染色及western blot实验，观察各实验组海马NMDA受体及AMPA受体表达变化。 结果： 1.免疫组化鉴定显示BDV成功感染各组实验大鼠。Morris水迷宫行为学测评显示BDV感染后大鼠出现学习记忆障碍。BDV感染后NMDA、AMPA药物干预组大鼠出现学习记忆障碍。BDV感染后MK801、CNQX药物干预组大鼠没有出现学习记忆障碍。 2.BDV感染后大鼠海马神经元基本膜电特性无明显改变。BDV感染后大鼠海马神经元自发性兴奋性突触后电流释放频率降低，囊泡释放减少；BDV感染后NMDA、AMPA药物干预组大鼠海马神经元自发性兴奋性突触后电流释放频率降低，囊泡释放减少；BDV感染后MK801、CNQX药物干预组大鼠海马神经元自发性兴奋性突触后电流释放频率、囊泡释放无明显变化。 3.H&E染色显示BDV感染后各组大鼠海马神经元分布、形态、数量无明显改变。 免疫组化染色显示BDV感染后大鼠海马神经元 AMPA受体、NMDA受体 NR1表达阳性细胞数明显减少；BDV感染后NMDA、AMPA药物干预组大鼠海马神经元AMPA受体、NMDA受体NR1表达阳性细胞数明显减少；而BDV感染后MK801、CNQX药物干预组阳性细胞数明显增加。 Western blot染色显示BDV感染后大鼠海马神经元NMDA受体NR1表达量明显减少；BDV感染后NMDA、AMPA药物干预组NMDA受体NR1表达量明显减少，BDV感染后MK801、CNQX药物干预组大鼠海马神经元NMDA受体NR1表达量明显增加。 BDV感染后AMPA受体表达量无明显变化；而BDV感染后NMDA、AMPA、MK801、CNQX药物干预组AMPA受体表达量均增加。 结论： 1.成功建立博尔纳病病毒 Hu-H1感染新生大鼠及药物干预动物模型。 2.BDV感染后大鼠出现学习记忆障碍；海马神经元突触前囊泡释放减少是导致大鼠学习记忆障碍的突触前机制。BDV感染后海马神经元谷氨酸受体表达下降；可能是导致大鼠学习记忆障碍的重要机制之一。 3.BDV感染后在体腹腔注射谷氨酸受体拮抗剂干预可以阻止大鼠出现学习记忆障碍。 4.谷氨酸受体拮抗剂可能通过保护新生大鼠谷氨酸受体的发育发挥作用。 本研究通过建立新生大鼠BDV感染模型，并在体注射谷氨酸受体激动剂、拮抗剂进行药物干预，采用脑片膜片钳技术、免疫组化技术及western blot观察探讨BDV感染后大鼠学习记忆障碍的神经机制，为后续深入研究BDV的致病机制提供了参考和新的研究切入点。