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1目的
乳腺癌是成年女性最常见的恶性肿瘤之一。大约1/3乳腺癌患者呈雌激素受体(ER)阴性,与ER阳性乳腺癌比较,其恶性程度较高,对化疗及内分泌治疗不敏感,预后更差,目前没有理想的治疗方法。ER阴性乳腺癌的治疗是目前临床的难点,因此本研究探讨粉防己碱对ER阴性人乳腺癌MDA-MB-435S细胞作用及其机制,以及对人乳腺癌细胞MCF-7荷瘤裸鼠作用及其机制,以为临床治疗奠定进一步研究的基础。
2方法
2.1体外实验部分
用MTT方法检测粉防己碱7个不同浓度组干预乳腺癌MDA-MB-435S细胞24h、48h、72h、96h后细胞的光吸收值(OD),划细胞生长曲线,并计算各组细胞抑制率及半数抑制浓度(IC50),说明粉防已碱对人乳腺癌MDA-MB-435S细胞体外生长的抑制作用。
碘化丙啶(PI)单染流式细胞术测定法进行粉防己碱4个不同浓度组对人乳腺癌MDA-MB-435S细胞周期分析,观察不同浓度粉防己碱干预24h后各组G0/G1期、G2M期、S期的细胞百分比分布。
利用Annexin V-FITC、Pl双标记细胞凋亡检测法检测粉防已碱4个不同浓度组干预人乳腺癌MDA-MB-435s细胞24h、48h后对细胞凋亡的影响。
2.2体内实验部分
建立裸鼠人乳腺癌MCF-7细胞移植瘤动物模型,把24只成瘤动物随机分为模型组、粉防己碱组、阳性对照组,每组8只,共给药15天。治疗期间观察并记录各组裸鼠移植瘤的生长情况及移植瘤体积,药物处理结束后1天,处死裸鼠,称各组裸鼠移植瘤重,并计算抑瘤率。利用光镜及透射电镜观察各组移植瘤组织病理学变化和超微结构变化。利用图像定量分析方法观察各组移植瘤组织的Bcl-2、Bax、Survivin及VEGF蛋白表达水平。
3结果
3.1体外实验部分
粉防己碱7个不同浓度组(Tet-0.5组、Tet-1组、Tet-2组、Tet-4组、Tet-6组、Tet-8组、Tet-16组)与同时间点正常对照组(control-1)比较OD值显著降低(P<0.05或0.01),并且随着粉防己碱浓度增加,其OD值降低。同一时间点的药物的抑制率随着粉防己碱浓度的增加而增大,存在量效关系。随着时间的延长,粉防己碱对MDA-MB-435S细胞体外生长的抑制作用增大,存在时间效应。粉防已碱作用于MDA-MB-435S细胞,剂量与时间之间存在交互作用(P<0.01)。24h、48h、72h、96h的IC50值分别为8.748μg/ml、3.585μg/ml、1.451μg/ml、1.117μg/ml。
粉防已碱4个不同浓度组(Tet-0.5组、Tet-1组、Tet-2组、Tet-4组)作用于MDA-MB-435S乳腺癌细胞24h后,与同期正常对照组比较,S期、G2M期细胞比例均明显降低,差异具有统计学意义(均P<0.05),并且随粉防己碱浓度增加,S期、G2M期细胞比例降低；G0/G1期细胞比例均显著增高,差异具有统计学意义(均P<0.05),并且随粉防已碱浓度增加,G0/G1期细胞比例增高。
作用24h后粉防已碱4个不同浓度组(Tet-0.5组、Tet-1组、Tet-2组、Tet-4组)的早期凋亡率与control-1组比较均增多,差异具有统计学意义(均P<0.05)；48h后与control-1组比较,Tet-1组、Tet-2组、Tet-4组的早期凋亡率显著增多(均P<0.05)；24h、48h早期凋亡率与药物浓度呈正相关(均P<0.05)；并且随作用时间延长,诱导早期凋亡率增加。24h后粉防己碱组晚期凋亡率与control-1组比较无差异(均P>0.05)；随作用时间延长,48h后粉防已碱高浓度组的晚期凋亡率逐渐增多,与control-1组比较差异有统计学意义(均P<0.05)。
3.2体内实验部分
用药第6天以后粉防已碱组和阳性对照组移植瘤体积与同一天的模型组比较显著减小(P<0.05或0.01)；但粉防已碱组和阳性对照组之间无差异(均P>0.05)。粉防已碱组、阳性对照组瘤重比模型组显著降低(P<0.05或0.01)；但粉防已碱组与阳性对照组之间无差异(P>0.05)。粉防己碱组和阳性对照组的抑瘤率分别为25.47％和30.43％。粉防已碱组、阳性对照组移植瘤组织病理学提示腺癌组织中可见坏死及不完全坏死细胞,凋亡现象比模型组增加,凋亡细胞较多。透射电镜观察发现粉防己碱组可见多量凋亡小体形成。
与模型组比较,粉防己碱组和阳性对照组均能降低Bcl-2阳性细胞面积、光密度值和免疫组化指数(P<0.05或0.01)。与模型组比较,粉防己碱组和阳性对照组均能增高Bax阳性细胞面积和免疫组化指数(均P<0.01),粉防已碱组Bax光密度值与模型组比较无差异(P>0.05)。粉防己碱组、阳性对照组Survivin阳性细胞面积和免疫组化指数与模型组比较显著降低(均P<0.01),但粉防己碱组、阳性对照组Survivin光密度值与模型组比较无差异(均P>0.05)。与模型组比较,粉防已碱组和阳性对照组均能降低VEGF阳性细胞面积、光密度值和免疫组化指数(均P<0.01),粉防已碱组和阳性对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
4结论
(1)首次发现粉防已碱对雌激素受体阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-435S增殖有明显抑制作用,为临床用于雌激素受体阴性乳腺癌治疗方面提供了基础研究数据。
(2)粉防已碱分别干预MDA-MB-435S细胞24h、48h后可诱导早期凋亡,早期凋亡率与药物浓度呈正相关,且存在浓度和时间依赖性,其最佳浓度范围为0.5μg/ml～4μg/ml。
(3)粉防已碱阻滞MDA-MB-435S细胞于G0/G1期,降低S期比例,抑制DNA合成是其抑制乳腺癌细胞生长的机制之一。
(4)粉防已碱对MCF-7裸鼠移植瘤的生长有抑制作用。
(5)粉防已碱抑制MCF-7裸鼠移植瘤生长的作用机制与下调Bcl-2、Survivin、上调Bax蛋白表达而诱导凋亡有关,同时与下调VEGF蛋白表达而抗肿瘤新生血管形成有关。