【摘 要】
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本文利用乳糖代替IPTG作为诱导剂，对含有D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pWY中的DAAO进行诱导表达。通过摇瓶发酵，初步研究了乳糖浓度、菌体浓度、诱导温度
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本文利用乳糖代替IPTG作为诱导剂，对含有D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pWY中的DAAO进行诱导表达。通过摇瓶发酵，初步研究了乳糖浓度、菌体浓度、诱导温度、诱导时间对DAAO表达的影响，结果表明：当菌浓OD<,600>达1.0左右、乳糖浓度为10g/L、28℃下诱导约6h，摇瓶发酵得到的DAAO酶活高达2400U/L。在5L自控式发酵罐上进行表达时，对其高密度发酵的诱导温度进行了进一步优化，分别在23℃、25℃、28℃、32℃和37℃下进行乳糖诱导表达，通过pH控制，葡萄糖消耗结束后，开始降温并分两次补加乳糖进行诱导，在28℃乳糖浓度1％诱导发酵约22h，酶活最高达3784.32U/L，菌浓(OD<,600>)达27.44。
并且利用本实验室自制的金属螯合载体EPI-30-ARG-IDA-Co<2+>对这种带有6个组氨酸的重组D-氨基酸氧化酶(DAAO)进行一步分离纯化，其纯化倍数为10倍，酶活回收率达38.35％，SDS-PAGE显示为单一条带，纯酶液经环氧载体Eupergit C固定化处理后，其最适反应温度提高到40℃、最适反应pH向碱性偏移，固定化酶对温度和pH的稳定性提高，表观米氏常数增大。固定化酶活力回收达到42.44％。
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