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目的：
白血病和淋巴瘤是临床上常见的血液系统恶性肿瘤,目前对于白血病和淋巴瘤的治疗主要是化疗和放疗,但化学合成药物和放疗往往具有很大的毒副作用,对正常的细胞有极大的损伤,因此许多学者致力于从毒副作用相对较小的中药中寻找抗肿瘤药物,并取得了一定的成就。全蝎或蝎毒作为传统的中药已经有几千年的应用历史。蝎毒为全蝎的主要活性物质,存在于蝎尾部毒囊内。蝎毒的生物活性成分主要是蛋白质,它们具有广泛的药理学作用。近年来国内外有关蝎毒抗肿瘤的研究有不少报道,但其抗肿瘤的机制还不完全清楚。本研究探讨蝎毒组分Ⅲ(scorpion venom componentⅢ,SVCⅢ)在白血病和淋巴瘤治疗中的应用价值,观察了蝎毒对几种白血病细胞系THP-1、Jurkat、MT2、IM-9和人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)增殖的影响,进一步探讨了SVCⅢ对THP-1和Jurkat细胞细胞周期及对核因子-κB(Nuclearfactor-κB,NF-κB)活性的影响。
方法：
1.将生长状态良好的白血病细胞系(THP-1、Jurkat、MT2和IM-9)和从健康人外周血分离的PBMC分别接种于96孔细胞培养板,每孔2×104细胞数,用不同浓度的SVCⅢ刺激后分别培养24h、48h和72h,MTT方法检测细胞的增殖情况,并推算SVCⅢ对不同细胞的半数抑制率(IC50)。
2.选取THP-1和Jurkat两种细胞接种于24孔细胞培养板,用1/2 IC50和IC50浓度的SVCⅢ处理细胞48h,离心收集细胞,用碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)对细胞进行染色,沈涤并收集细胞在流式细胞仪上检测细胞周期的分布。
3.将THP-1和Jurkat细胞接种于6孔细胞培养板,用1/2 IC50和IC50浓度的SVCⅢ处理细胞,在不同时间点收集细胞,用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白或胞浆蛋白和胞核蛋白,用Western blotting方法分别检测cyclin D1、p65、IκBα和p-IκBα蛋白的表达情况。
4.将THP-1细胞和Jurkat细胞以每孔2×105细胞数分别接种于24孔细胞培养板,用1/2 IC50和IC50浓度的SVCⅢ处理细胞24h,Trizol试剂提取每种细胞的总RNA,RT-PCR方法检测细胞p65 mRNA的表达。
5.将THP-1和Jurkat细胞接种于24孔细胞培养板,用Transfast1M脂质体转染NF-κB荧光素酶报告基因质粒,转染42 h后用不同浓度的SVCⅢ(1/2 IC50和IC50)刺激6h,收集细胞并裂解细胞,取上清加入荧光素酶底物,迅即在发光检测仪上检测荧光强度。与对照组比较,计算SVCⅢ各处理组的相对荧光表达情况。
6.将THP-1和Jurkat细胞接种于6孔细胞培养板,SVCⅢ处理细胞2h,用核蛋白提取试剂盒分别提取细胞的核蛋白,用化学发光法EMSA检测NF-κB特异探针与NF-κB转录因子的结合。
结果：
1.SVCⅢ对白血病细胞增殖的影响MTT结果显示SVCⅢ对四种白血病细胞THP-1、Jurkat、MT2和IM-9细胞均具有明显的生长抑制作用,且呈现浓度和时间相关性,各组间经统计学处理有显著性差异(p＜0.05)。但SVCⅢ对人PBMC的抑制作用不明显,无统计学意义。同时发现这四种白血病细胞对SVCⅢ的敏感性不同,其中THP-1和IM-9细胞对SVCⅢ更为敏感。SVCⅢ处理Jurkat、MT2、IM-9和THP-1这四种细胞48h后,推算它们的IC50值分别为39.6μg/ml、36.44μg/ml、27.10μg/ml和29.04μg/ml。
2.SVCⅢ对THP-1和Jurkat细胞细胞周期的影响白血病细胞THP-1和Jurkat细胞经1/2 IC50和IC50浓度的SVC-Ⅲ作用48h后,结果出现G0/G1期细胞数明显增加,G2期及S期细胞数减少,并且随着药物浓度的增加G0/G1期细胞比例逐渐增加,S期细胞比例逐渐减少。各组间统计学处理有显著差异。
3。SVCⅢ对THP-1和Jurkat细胞cyclin D1蛋白表达的影响THP-1和Jurkat细胞分别经1/2 ICS0和IC50浓度的SVC-Ⅲ作用24h后,cyclin D1蛋白的表达显著降低,并呈现剂量相关性,与对照组相比有统计学意义(p＜0.05)。
4.SVCⅢ对THP-1和Jurkat细胞内p65mRNA和p65蛋白的影响SVCⅢ可以抑制THP-1和Jurkat细胞内p65 mRNA的表达,并呈现剂量相关性。但对THP-1细胞p65蛋白的影响不同,THP-1细胞经SVCⅢ作用后,细胞浆中p65蛋白虽有所降低,但与对照组比较无显著差异,不同浓度组间比较也无差异,而细胞核中p65蛋白量是逐渐降低,且呈一定剂量相关性。
5.SVCⅢ对THP-1和Jurkat细胞NF-κB活性的影响THP-1和Jurkat细胞经不同浓度SVCⅢ(1/2 IC50和IC50)作用6h后,随着SVCⅢ浓度的增加,NF-κB荧光素酶报告基因的转录活性逐渐降低,同时细胞核蛋白与NF-κB探针的结合能力也逐渐降低,呈一定剂量相关性。
6.SVCⅢ与Bay11-7082具有协同作用Bay11-7082(NF-κB抑制刺)预处理THP-1细胞1h后,再用SVCⅢ刺激细胞,结果发现联合用药呈现叠加效应,不仅使THP-1细胞内磷酸化的IκKα水平进一步降低,而且cyclinD1蛋白的表达也显著降低。
结论：
1.SVCⅢ可以抑制四种自血病细胞(Jurkat,THP-1,IM-9和MT2细胞)的增殖,且具有一定的制量和时间相关性,不同的细胞对SVCⅢ的敏感性并不相同,但SVCⅢ对健康正常人PBMC无显著影响。
2.SVCⅢ可以将白血病细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期,这种阻滞作用可能是通过对细胞周期调节蛋白cyclin D1的作用而实现。
3.SVCⅢ可以通过抑制IκBα的磷酸化而抑制NF-κB的活化,进一步对细胞增殖起到抑制作用。