长江江豚及蝙蝠B淋巴细胞刺激因子(BAFF)的克隆、表达、及生物学功能研究

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本论文共包括四个部分:  1.综述近年来B淋巴细胞刺激因子(BAFF)的研究进展。  2.江豚及蝙蝠的研究进展。  3.本实验中,通过RT-PCR和RACE技术,从江豚(Neophocaena phocaenoides)血液中扩增得到B淋巴细胞刺激因子(NpBAFF)的全长cDNA序列,并且鉴定了它的生物学活性。NpBAFF是从水生哺乳动物中获得的第一个BAFF基因。NpBAFF cDNA全长为1502 bp,包括852bp的开放阅读框(编码283个氨基酸)。与其它物种已知BAFF相同,NpBAFF氨基酸序列中也含有一个预测的跨膜区,一个弗林酶切位点和一个典型的TNF结构域。NpBAFF与其它已知哺乳动物牛、猪、羊、狗在氨基酸水平上的同源性分别为87.68%,76.33%,87.68%,和82.19%。预测的NpBAFF三维结构显示与人的三维结构非常类似。系统进化树结果显示江豚与偶蹄目哺乳动物在进化上最接近。我们在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了重组可溶性SUMO-NpsBAFF蛋白,并对其进行SDS-PAGE和western blot分析鉴定。激光共聚焦观察显示NpsBAFF可以结合到小鼠淋巴细胞表面。体外MTT检测表明SUMO-NpsBAFF与anti-IgM共刺激促进了小鼠脾脏淋巴细胞的存活。这表明NpBAFF能够促进淋巴细胞的存活,并且在鲸类与其它哺乳动物之间存在功能交叉反应。本实验的研究结果可以为以后江豚免疫系统的研究提供一定的帮助。  4.通过RT-PCR和RACE技术,从蝙蝠(Vespertilio superans Thomas)脾脏中扩增得到B淋巴细胞刺激因子(bBAFF)的全长cDNA序列,并且鉴定了它的生物学活性。bBAFF的开放阅读框为873 bp,编码290个氨基酸。序列比对显示bBAFF含有一个TNF结构域,一个跨膜区,一个推测的弗林酶切位点和三个保守的半胱氨酸残基。实时定量PCR(Real-time PCR)分析显示bBAFF主要表达在蝙蝠的免疫器官脾脏中。SUMO-bsBAFF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并通过SDS-PAGE和western blot证实。体外MTT检测显示SUMO-bsBAFF与anfi-IgM共刺激促进了小鼠脾脏淋巴细胞的存活。这不仅说明bBAFF在淋巴细胞的存活中起着重要作用,而且还证明了哺乳动物之间的功能交叉反应。
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