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结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤,发生率高居全球恶性肿瘤第四位,年累计人数约100万,主要发生在50岁以上的中老年人,临床多以手术治疗为主,但仍有大部分患者在术前或术后容易发生远处转移,且预后恢复较差,因此探寻结直肠癌发生发展的分子靶向机制,对于结直肠癌的诊疗具有重要意义.
研究发现肾母细胞瘤1-结合蛋白( Wilms Tumor 1-Associating Protein,WTAP)作为一种重要的RNA甲基转移酶,同甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like protein 3,METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase-like protein 14,METTL14)共同参与人体N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)修饰,通过调控RNA翻译、稳定性以及可变剪接等方面,从而影响人类癌症的发生与发展.除此之外,多项研究表明WTAP在膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、白血病、胶质母细胞瘤、胆管癌、胰腺导管腺癌等多种癌细胞中呈高表达状态,具有一定的促癌效应,并且可以影响癌细胞的增殖和迁移等,但在结直肠癌中的表达情况以及对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响鲜有明确报道,因此本研究旨在探求WTAP在结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞的作用.
本实验前期选取人结直肠癌组织样本和正常结肠上皮组织样本制成组化切片,通过免疫组化实验检测WTAP的表达情况,同时选取七种人结直肠癌细胞系HCT8、HT29、HCT106、HCT116、SW620、SW480与LoVo,利用Western blotting检测WTAP蛋白的表达情况,筛选出相对高表达WTAP的结直肠癌细胞系HCT8、HCT116与LoVo.根据哺乳动物真核细胞shRNA的Tuschl AA-19 nt的设计原则,从WTAP基因的mRNA序列中筛选1条靶序列,并合成相应的正义和反义DNA模板.利用Ambion shRNA在线软件设计了针对WTAP的shWTAP序列:5-GATCCCCGGCAAGTACACAGATCTTAATTCAAGAGATTAAGATCTGTGTACTTGCCTTTTTA-3,3-AGCTTAAAAAGGCAAGTACA CAGATCTTAATCTCTTGAATTAAGATCTGTGTACTTGCCGGG-5,靶向敲低WTAP基因,构建出慢病毒目的质粒277-iWTAP,对照选用277空载体质粒,利用慢病毒转染法在HEK293T细胞中包装慢病毒后分别感染HCT8、HCT116与LoVo细胞,荧光显微镜下观察GFP表达强度判断感染效果,筛选出感染效果较好的一组细胞株shWTAP-HCT116 ( shWTAP组)与shRNA-Control-HCT116 ( Control组) ,并且通过Real-Time PCR和Western blotting分别检测转染后WTAP基因mRNA和蛋白表达水平的变化,最后通过CCK8实验和划痕愈合实验分别检测细胞增殖和迁移能力的变化.
结果显示,WTAP在结直肠癌组织中呈高表达,在所选取的七种结直肠癌细胞中都有表达,但在HCT8、HCT116与LoVo细胞中相对高表达.构建成功的慢病毒目的质粒277-iWTAP转染高表达WTAP的结直肠癌细胞后,选取的shWTAP组细胞WTAP基因的mRNA和蛋白表达水平显著降低,细胞的增殖和迁移能力也随之明显降低,与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).
综上所述,靶向敲低WTAP基因的表达对人结直肠癌HCT116细胞的增殖、迁移能力有显著抑制作用,推测WTAP基因的异常过表达促进人结直肠癌的发生发展,因此可能是结直肠癌诊疗的一个潜在靶点.
研究发现肾母细胞瘤1-结合蛋白( Wilms Tumor 1-Associating Protein,WTAP)作为一种重要的RNA甲基转移酶,同甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like protein 3,METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase-like protein 14,METTL14)共同参与人体N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)修饰,通过调控RNA翻译、稳定性以及可变剪接等方面,从而影响人类癌症的发生与发展.除此之外,多项研究表明WTAP在膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、白血病、胶质母细胞瘤、胆管癌、胰腺导管腺癌等多种癌细胞中呈高表达状态,具有一定的促癌效应,并且可以影响癌细胞的增殖和迁移等,但在结直肠癌中的表达情况以及对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响鲜有明确报道,因此本研究旨在探求WTAP在结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞的作用.
本实验前期选取人结直肠癌组织样本和正常结肠上皮组织样本制成组化切片,通过免疫组化实验检测WTAP的表达情况,同时选取七种人结直肠癌细胞系HCT8、HT29、HCT106、HCT116、SW620、SW480与LoVo,利用Western blotting检测WTAP蛋白的表达情况,筛选出相对高表达WTAP的结直肠癌细胞系HCT8、HCT116与LoVo.根据哺乳动物真核细胞shRNA的Tuschl AA-19 nt的设计原则,从WTAP基因的mRNA序列中筛选1条靶序列,并合成相应的正义和反义DNA模板.利用Ambion shRNA在线软件设计了针对WTAP的shWTAP序列:5-GATCCCCGGCAAGTACACAGATCTTAATTCAAGAGATTAAGATCTGTGTACTTGCCTTTTTA-3,3-AGCTTAAAAAGGCAAGTACA CAGATCTTAATCTCTTGAATTAAGATCTGTGTACTTGCCGGG-5,靶向敲低WTAP基因,构建出慢病毒目的质粒277-iWTAP,对照选用277空载体质粒,利用慢病毒转染法在HEK293T细胞中包装慢病毒后分别感染HCT8、HCT116与LoVo细胞,荧光显微镜下观察GFP表达强度判断感染效果,筛选出感染效果较好的一组细胞株shWTAP-HCT116 ( shWTAP组)与shRNA-Control-HCT116 ( Control组) ,并且通过Real-Time PCR和Western blotting分别检测转染后WTAP基因mRNA和蛋白表达水平的变化,最后通过CCK8实验和划痕愈合实验分别检测细胞增殖和迁移能力的变化.
结果显示,WTAP在结直肠癌组织中呈高表达,在所选取的七种结直肠癌细胞中都有表达,但在HCT8、HCT116与LoVo细胞中相对高表达.构建成功的慢病毒目的质粒277-iWTAP转染高表达WTAP的结直肠癌细胞后,选取的shWTAP组细胞WTAP基因的mRNA和蛋白表达水平显著降低,细胞的增殖和迁移能力也随之明显降低,与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).
综上所述,靶向敲低WTAP基因的表达对人结直肠癌HCT116细胞的增殖、迁移能力有显著抑制作用,推测WTAP基因的异常过表达促进人结直肠癌的发生发展,因此可能是结直肠癌诊疗的一个潜在靶点.