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目的：肿瘤相关巨噬细胞在实体肿瘤浸润的免疫细胞中占比最高，其表型与功能受肿瘤细胞与基质细胞等微环境的信号调控。肿瘤相关巨噬细胞能通过多种机制促进肿瘤进展。大多数肿瘤细胞采取糖酵解的方式代谢葡萄糖，在肿瘤局部产生大量乳酸。乳酸能调控多种信号通路，或直接作为信号分子调节细胞的生长和分化。但肿瘤来源的乳酸如何影响肿瘤相关巨噬细胞表型与功能以及肿瘤的进展并不完全清楚。我们采用肿瘤细胞来源的条件性培养基刺激巨噬细胞，结果发现巨噬细胞溶酶体蛋白ATP6V0d2表达受明显抑制，因此本研究将探讨溶酶体蛋白Atp6v0d2对肿瘤相关巨噬细胞功能的调控，以及影响肿瘤进展的分子机制。
一．方法
1.Real-time PCR分析小鼠肺腺癌细胞LLC培养上清（LLC-TCM）或小鼠黑色素肿瘤细胞B16-F10培养上清(B16-F10-TCM)对小鼠BMDMs的溶酶体蛋白复合体vacuolar ATPase(v-ATPase)各亚基的基因表达的影响，验证肿瘤细胞培养上清中的乳酸下调Atp6v0d2的表达，流式染色以及Western Blot分析相关信号通路的变化。
2. 成功构建C57BL/6背景的Atp6v0d2全基因敲除小鼠，将小鼠肺腺癌细胞系LLC或黑色素瘤细胞系B16-F10皮下接种野生WT小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠，每天观察测量皮下肿瘤大小，接种第15天后处死WT小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠，分离肿瘤组织，称量两组肿瘤重量。Real-time PCR分析Atp6v0d2在肿瘤细胞，淋巴细胞，成纤维细胞以及巨噬细胞的表达量。为了进一步验证Atp6v0d2缺陷的巨噬细胞对肿瘤生长的影响，利用肿瘤细胞和巨噬细胞共接种模型，即将正常对照WT小鼠或Atp6v0d2-/-小鼠的BMDMs与肿瘤细胞按照1:2混合后共接种于Atp6v0d2-/-小鼠皮下，每天观察测量皮下肿瘤大小。
3. 将小鼠肺腺癌细胞系LLC（8×105）尾静脉接种正常对照组小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠，16后处死小鼠，观察统计WT小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠肺部成瘤情况，分离两组小鼠的肺组织并将，消化成单个细胞悬液，流式检测分析WT小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠中巨噬细胞极化情况以及肿瘤细胞的增殖凋亡情况。
4. WT 组和 Atp6v0d2-/-组接种肿瘤后，取皮下肿瘤组织消化成单细胞悬液，经CD11b磁珠分选出肿瘤相关巨噬细胞，流式染色检测WT组和Atp6v0d2-/-组荷瘤小鼠肿瘤相关巨噬细胞极化的差异；Ral-time PCR检测WT组和Atp6v0d2-/-组荷瘤小鼠肿瘤组织和 CD11b 磁珠分选后的巨噬细胞中 Mrc-1, Arg-1, Fizz-1,IL-1β以及Il-6基因的表达。体外用小鼠肺腺癌细胞LLC培养上清（LLC-TCM）刺激WT或Atp6v0d2-/-小鼠BMDMs不同时间（6, 36h）， Ral-time PCR检测巨噬细胞的炎性相关基因IL-1β，Il-6的表达和促肿瘤巨噬细胞相关的基因Mrc-1, Arg-1, Fizz-1的表达。
5. 皮下肿瘤模型中，免疫荧光染色（CD31 和 α-SMA）分析比较 WT 小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠肿瘤组织内血管异生情况；HE 染色分析比较 WT 小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠肿瘤组织内缺血坏死情况；ELISA 进一步验证 WT 小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠肿瘤组织内血管生长因子（VGEF）的表达情况；同时Real-time PCR检测WT小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠的肿瘤组织和CD11b磁珠分选过后的巨噬细胞中Vegf的表达差异；体外用LLC-TCM和B16-F10-TCM刺激WT和Atp6v0d2-/-的BMDMs 6h，Real-PCR检测Vegf的表达差异。
6. 皮下肿瘤模型中，WT 和 Atp6v0d2-/-小鼠的肿瘤组织免疫荧光染色（HIF-2α和 F4/80），分析比较肿瘤内巨噬细胞表达 HIF-2α 蛋白水平的差异；由于HIF-1α也是调控血管生成的一个很重要的转录因子，为了排除HIF-1α的作用。在常氧或缺氧（1%O2）条件，用LLC-TCM刺激WT和Atp6v0d2-/-巨噬细胞不同时间（0，2，4，6h），Western Blot分别检测巨噬细胞HIF-1α，HIF-2α， P62和LC3蛋白的表达差异；构建过表达ATP6V0d2的逆转录病毒，体外在常氧条件下用 LLC-TCM 刺激 control 和过表达 ATP6V0d2 的 BMDMs， Western Blot检测HIF-2α，ATP6V0d2，P62和LC3蛋白的表达差异；为了排除蛋白酶体的影响，体外用蛋白酶体的抑制剂（ MG132 ）处理 WT 和Atp6v0d2-/-BMDMs不同时间（0，2，4，6h），Western Blot检测HIF-2α，P62和LC3蛋白的表达差异；为了验证WT与Atp6v0d2-/- BMDMs中HIF-2α的表达差异与溶酶体有关；因此体外用溶酶体的抑制剂（BafA）处理 WT 和Atp6v0d2-/-BMDMs6h，Western Blot检测HIF-2α，P62和LC3蛋白的表达差异；与此同时，MG132处理WT和Atp6v0d2-/-BMDMs4h，免疫荧光检测并分析WT和Atp6v0d2-/-BMDMs中HIF-2α与溶酶体的标志物（Lyso-tracker）共定位的差异。
7. 特异性HIF-2α抑制小鼠动物实验：LLC细胞（5×105）接种WT 和Atp6v0d2-/-小鼠10天后口服HIF-2α特异性抑制剂（PT2385），每天观察并记录肿瘤大小，在第15天后处死WT组小鼠，Atp6v0d2-/-小鼠，给与HIF-2α抑制剂处理的WT组小鼠或Atp6v0d2-/-小鼠，分离肿瘤组织，称量各组肿瘤重量；免疫荧光染色（CD31和α-SMA）分析比较四组小鼠肿瘤组织内血管异生情况；Ral-time PCR检测四组小鼠肿瘤组织中Mrc-1,Arg-1,Fizz-1和Ym-1的表达差异；为了进一步证实 HIF-2α 对肿瘤相关巨噬细胞极化的调控，体外预先用HIF-2α特异性抑制剂预处理WT和Atp6v0d2-/-的巨噬细胞18h，然后用LLC肿瘤培养上清（LLC-TCM）刺激WT和Atp6v0d2-/-的BMDMs24h，Real-time PCR检测WT和Atp6v0d2-/-小鼠BMDMs极化相关基因Mrc-1, Arg-1, Fizz-1的表达差异。
8. 验证临床相关性：为了验证 HIF-2α 特异性表达在巨噬细胞中，免疫荧光检测人的肺腺癌组织中HIF-2α与巨噬细胞CD68的共定位情况；进一步分析巨噬细胞表达ATP6V0d2与HIF-2α之间的关系，对肺癌病人的癌组织或癌旁部位进行HE和组织化学化染色，统计分析CD163，ATP6V0d2和HIF-2α之间的相关性；按照ATP6V0d2表达高低评分将肺癌病人分成ATP6V0d2高表达组和ATP6V0d2低表达组，分析ATP6V0d2的表达高低与病人生存时间及生存率的关系；统计分析ATP6V0d2的表达高低与肿瘤组织内极化的巨噬细胞的数目之间的关系，同时统计分析 HIF-2α 的表达高低与病人生存时间的关系。
二．结果
1) LLC-TCM明显下调BMDMs中溶酶体蛋白Atp6v0d2的表达，但是不抑制其它亚基的表达，并且Atp6v0d2的下调表达与LLC-TCM的量呈现浓度梯度依赖，说明Atp6v0d2的表达不受培养基中营养的缺乏和pH的影响；煮沸后的 LLC-TCM 依然能够明显抑制 Atp6v0d2 的表达，提示LLC-TCM 中含有某种特殊稳定成分，而不是细胞因子或者蛋白成分抑制Atp6v0d2的表达；因肿瘤细胞糖酵解代谢活跃，检测了LLC-TCM中乳酸含量，显示 LLC-TCM中的乳酸含量丰富，体外不同浓度的乳酸刺激WT小鼠BMDMs依次呈现浓度梯度依赖的的Atp6v0d2下调表达，与LLC-TCM结果相一致，同时乳酸转运子MCT1的抑制剂（CHX）又可以逆转 LLC-TCM 对 BMDMs 中 Atp6v0d2 的下调表达作用，这就提示LLC-TCM 中的乳酸可以抑制 BMDMs 中 Atp6v0d2 的表达，同时LLC-TCM可以活化BMDM 中mTORC1信号通路，抑制溶酶体的重要转录因子TFEB的入核。由于Atp6v0d2是TFEB的靶基因，因此乳酸通过活化溶酶体中mTORC1活性，降低TFEB的入核，从而抑制BMDMs中Atp6v0d2的表达。
2) 皮下肿瘤模型结果显示，相较于WT小鼠，Atp6v0d2-/-小鼠接种LLC和B16-F10 肿瘤细胞后，其肿瘤生长更为迅速，并且肿瘤重量明显偏重；ATP6V0d2只在肿瘤相关的巨噬细胞中有表达，而在其他如T细胞，基质细胞以及肿瘤细胞中不表达；巨噬细胞与肿瘤细胞共接种实验揭示Atp6v0d2-/-小鼠BMDMs能够显著促进肿瘤细胞的生长。
3) 肺部成瘤模型结果显示，Atp6v0d2-/-小鼠肺部有更多的肿瘤结节形成，并且 Atp6v0d2-/-小鼠肺组织的巨噬细胞极化的比例明显增加；同时Atp6v0d2-/-小鼠肺部肿瘤中肿瘤细胞的增殖比例明显高于WT组，其肿瘤细胞的凋亡也显著低于WT组。
4) WT和Atp6v0d2-/-小鼠皮下瘤模型结果显示，Atp6v0d2-/-小鼠皮下肿瘤中巨噬细胞极化（ F4/80+CD206+）比例明显增加，但是其炎性巨噬细胞（F4/80+CD11c+）的比例与WT组相比没有差异；并且在肿瘤组织和分离后的TAM中巨噬细胞促肿瘤相关的基因如（Mrc-1,Arg-1,Fizz-1）表达上调，但是炎性相关的基因（Il-1β，Il-6）与WT组相比没有差异；体外用LLC-TCM刺激WT和Atp6v0d2-/-组BMDMs 6h和36h后，Real-time PCR 检测发现， Atp6v0d2-/-小鼠 BMDMs 的促肿瘤相关的基因（Arg-1,Fizz-1）表达显著升高，而其炎性相关的基因（Il-1β，Il-6）的表达与WT组相比没有差异，这与皮下肿瘤模型的结果相一致。
5) 皮下肿瘤模型组织染色发现，Atp6v0d2-/-小鼠皮下肿瘤块中异常血管明显增多，伴随着肿瘤内部坏死区域也显著增加；并且 ELISA 检测发现Atp6v0d2-/-小鼠皮下肿瘤中血管内皮生长因子（ VEGF ）的水平也高于WT组，肿瘤组织以及分选的 TAM 中 Vegf 的基因表达水平也高于 WT组；体外用LLC-TCM刺激WT和Atp6v0d2-/-BMDMs 6h，检测发现Atp6v0d2-/-组BMDMs表达更高的Vegf。
6) 肿瘤组织免疫荧光揭示，Atp6v0d2-/-小鼠皮下肿瘤中巨噬细胞表达更高的HIF-2α，体外一系列蛋白实验发现Atp6v0d2-/-的BMDMs中HIF-2α表达更高，伴随着自噬相关蛋白 P62,LC3 也增加；但 HIF-1α 在 WT 和Atp6v0d2-/-的BMDMs中的表达却没有差异；过表达ATP6V0d2后能够抑制 HIF-2α 的增加，同时 P62，LC3 也相应降低，溶酶体的抑制剂处理WT和Atp6v0d2-/-的BMDMs后，HIF-2α的蛋白水平在两者之间没有明显差异。免疫荧光揭示Atp6v0d2-/-的BMDMs中HIF-2α不能很好的与细胞内溶酶体共定位，但是在WT的HIF-2α能够很好的与溶酶体共定位，说明 Atp6v0d2 敲除后抑制 HIF-2α 的溶酶体降解途径，导致 Atp6v0d2-/-的BMDMs中HIF-2α表达高于WT组。
7) HIF-2α的特异性的抑制剂（PT2385）能够显著抑制WT和Atp6v0d2-/-小鼠皮下肿瘤的生长，并且能抑制异常血管的生成。同时抑制剂的给予能够逆转 Atp6v0d2-/-小鼠肿瘤组织中巨噬细胞促肿瘤相关的基因（Mrc-1,Arg-1,Fizz-1,Ym-1）的上调表达。体外实验发现，LLC-TCM 刺激后的 BMDMs 给予 PT2385 处理后发现，抑制剂能够逆转 Atp6v0d2-/-小鼠 BMDMs 中巨噬细胞促肿瘤相关的基因（Mrc-1,Arg-1,Fizz-1,Ym-1）的上调表达。这与上述肿瘤模型的结果相一致。
8) 临床肺腺癌病人结果发现，HIF-2α 主要表达在 CD68+阳性巨噬细胞中，并且 ATP6V0d2 高表达组的病人中 CD163+巨噬细胞的浸润数目以及HIF-2α的蛋白表达明显低于ATP6V0d2低表达组；同时ATP6V0d2高表达组的病人的生存期也显著高于ATP6V0d2低表达组，HIF-2α低表达组的病人的生存期也显著高于HIF-2α高表达组人。
三．结论
在肿瘤微环境中，肿瘤细胞来源的乳酸通过活化巨噬细胞mTORC1，抑制溶酶体的关键转录因子TFEB的入核，进而特异性下调Atp6v0d2的表达；Atp6v0d2的下调表达抑制HIF-2α的溶酶体降解途径，巨噬细胞的促肿瘤的极化表型增强以及产生的血管内皮生长因子（VEGF）增加进而促进了肿瘤的进展。与此同时，在肺腺癌的临床标本中发现ATP6V0d2的表达与肿瘤内巨噬细胞中HIF-2α的表达以及病人的疾病进展呈负相关。
一．方法
1.Real-time PCR分析小鼠肺腺癌细胞LLC培养上清（LLC-TCM）或小鼠黑色素肿瘤细胞B16-F10培养上清(B16-F10-TCM)对小鼠BMDMs的溶酶体蛋白复合体vacuolar ATPase(v-ATPase)各亚基的基因表达的影响，验证肿瘤细胞培养上清中的乳酸下调Atp6v0d2的表达，流式染色以及Western Blot分析相关信号通路的变化。
2. 成功构建C57BL/6背景的Atp6v0d2全基因敲除小鼠，将小鼠肺腺癌细胞系LLC或黑色素瘤细胞系B16-F10皮下接种野生WT小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠，每天观察测量皮下肿瘤大小，接种第15天后处死WT小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠，分离肿瘤组织，称量两组肿瘤重量。Real-time PCR分析Atp6v0d2在肿瘤细胞，淋巴细胞，成纤维细胞以及巨噬细胞的表达量。为了进一步验证Atp6v0d2缺陷的巨噬细胞对肿瘤生长的影响，利用肿瘤细胞和巨噬细胞共接种模型，即将正常对照WT小鼠或Atp6v0d2-/-小鼠的BMDMs与肿瘤细胞按照1:2混合后共接种于Atp6v0d2-/-小鼠皮下，每天观察测量皮下肿瘤大小。
3. 将小鼠肺腺癌细胞系LLC（8×105）尾静脉接种正常对照组小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠，16后处死小鼠，观察统计WT小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠肺部成瘤情况，分离两组小鼠的肺组织并将，消化成单个细胞悬液，流式检测分析WT小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠中巨噬细胞极化情况以及肿瘤细胞的增殖凋亡情况。
4. WT 组和 Atp6v0d2-/-组接种肿瘤后，取皮下肿瘤组织消化成单细胞悬液，经CD11b磁珠分选出肿瘤相关巨噬细胞，流式染色检测WT组和Atp6v0d2-/-组荷瘤小鼠肿瘤相关巨噬细胞极化的差异；Ral-time PCR检测WT组和Atp6v0d2-/-组荷瘤小鼠肿瘤组织和 CD11b 磁珠分选后的巨噬细胞中 Mrc-1, Arg-1, Fizz-1,IL-1β以及Il-6基因的表达。体外用小鼠肺腺癌细胞LLC培养上清（LLC-TCM）刺激WT或Atp6v0d2-/-小鼠BMDMs不同时间（6, 36h）， Ral-time PCR检测巨噬细胞的炎性相关基因IL-1β，Il-6的表达和促肿瘤巨噬细胞相关的基因Mrc-1, Arg-1, Fizz-1的表达。
5. 皮下肿瘤模型中，免疫荧光染色（CD31 和 α-SMA）分析比较 WT 小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠肿瘤组织内血管异生情况；HE 染色分析比较 WT 小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠肿瘤组织内缺血坏死情况；ELISA 进一步验证 WT 小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠肿瘤组织内血管生长因子（VGEF）的表达情况；同时Real-time PCR检测WT小鼠和Atp6v0d2-/-小鼠的肿瘤组织和CD11b磁珠分选过后的巨噬细胞中Vegf的表达差异；体外用LLC-TCM和B16-F10-TCM刺激WT和Atp6v0d2-/-的BMDMs 6h，Real-PCR检测Vegf的表达差异。
6. 皮下肿瘤模型中，WT 和 Atp6v0d2-/-小鼠的肿瘤组织免疫荧光染色（HIF-2α和 F4/80），分析比较肿瘤内巨噬细胞表达 HIF-2α 蛋白水平的差异；由于HIF-1α也是调控血管生成的一个很重要的转录因子，为了排除HIF-1α的作用。在常氧或缺氧（1%O2）条件，用LLC-TCM刺激WT和Atp6v0d2-/-巨噬细胞不同时间（0，2，4，6h），Western Blot分别检测巨噬细胞HIF-1α，HIF-2α， P62和LC3蛋白的表达差异；构建过表达ATP6V0d2的逆转录病毒，体外在常氧条件下用 LLC-TCM 刺激 control 和过表达 ATP6V0d2 的 BMDMs， Western Blot检测HIF-2α，ATP6V0d2，P62和LC3蛋白的表达差异；为了排除蛋白酶体的影响，体外用蛋白酶体的抑制剂（ MG132 ）处理 WT 和Atp6v0d2-/-BMDMs不同时间（0，2，4，6h），Western Blot检测HIF-2α，P62和LC3蛋白的表达差异；为了验证WT与Atp6v0d2-/- BMDMs中HIF-2α的表达差异与溶酶体有关；因此体外用溶酶体的抑制剂（BafA）处理 WT 和Atp6v0d2-/-BMDMs6h，Western Blot检测HIF-2α，P62和LC3蛋白的表达差异；与此同时，MG132处理WT和Atp6v0d2-/-BMDMs4h，免疫荧光检测并分析WT和Atp6v0d2-/-BMDMs中HIF-2α与溶酶体的标志物（Lyso-tracker）共定位的差异。
7. 特异性HIF-2α抑制小鼠动物实验：LLC细胞（5×105）接种WT 和Atp6v0d2-/-小鼠10天后口服HIF-2α特异性抑制剂（PT2385），每天观察并记录肿瘤大小，在第15天后处死WT组小鼠，Atp6v0d2-/-小鼠，给与HIF-2α抑制剂处理的WT组小鼠或Atp6v0d2-/-小鼠，分离肿瘤组织，称量各组肿瘤重量；免疫荧光染色（CD31和α-SMA）分析比较四组小鼠肿瘤组织内血管异生情况；Ral-time PCR检测四组小鼠肿瘤组织中Mrc-1,Arg-1,Fizz-1和Ym-1的表达差异；为了进一步证实 HIF-2α 对肿瘤相关巨噬细胞极化的调控，体外预先用HIF-2α特异性抑制剂预处理WT和Atp6v0d2-/-的巨噬细胞18h，然后用LLC肿瘤培养上清（LLC-TCM）刺激WT和Atp6v0d2-/-的BMDMs24h，Real-time PCR检测WT和Atp6v0d2-/-小鼠BMDMs极化相关基因Mrc-1, Arg-1, Fizz-1的表达差异。
8. 验证临床相关性：为了验证 HIF-2α 特异性表达在巨噬细胞中，免疫荧光检测人的肺腺癌组织中HIF-2α与巨噬细胞CD68的共定位情况；进一步分析巨噬细胞表达ATP6V0d2与HIF-2α之间的关系，对肺癌病人的癌组织或癌旁部位进行HE和组织化学化染色，统计分析CD163，ATP6V0d2和HIF-2α之间的相关性；按照ATP6V0d2表达高低评分将肺癌病人分成ATP6V0d2高表达组和ATP6V0d2低表达组，分析ATP6V0d2的表达高低与病人生存时间及生存率的关系；统计分析ATP6V0d2的表达高低与肿瘤组织内极化的巨噬细胞的数目之间的关系，同时统计分析 HIF-2α 的表达高低与病人生存时间的关系。
二．结果
1) LLC-TCM明显下调BMDMs中溶酶体蛋白Atp6v0d2的表达，但是不抑制其它亚基的表达，并且Atp6v0d2的下调表达与LLC-TCM的量呈现浓度梯度依赖，说明Atp6v0d2的表达不受培养基中营养的缺乏和pH的影响；煮沸后的 LLC-TCM 依然能够明显抑制 Atp6v0d2 的表达，提示LLC-TCM 中含有某种特殊稳定成分，而不是细胞因子或者蛋白成分抑制Atp6v0d2的表达；因肿瘤细胞糖酵解代谢活跃，检测了LLC-TCM中乳酸含量，显示 LLC-TCM中的乳酸含量丰富，体外不同浓度的乳酸刺激WT小鼠BMDMs依次呈现浓度梯度依赖的的Atp6v0d2下调表达，与LLC-TCM结果相一致，同时乳酸转运子MCT1的抑制剂（CHX）又可以逆转 LLC-TCM 对 BMDMs 中 Atp6v0d2 的下调表达作用，这就提示LLC-TCM 中的乳酸可以抑制 BMDMs 中 Atp6v0d2 的表达，同时LLC-TCM可以活化BMDM 中mTORC1信号通路，抑制溶酶体的重要转录因子TFEB的入核。由于Atp6v0d2是TFEB的靶基因，因此乳酸通过活化溶酶体中mTORC1活性，降低TFEB的入核，从而抑制BMDMs中Atp6v0d2的表达。
2) 皮下肿瘤模型结果显示，相较于WT小鼠，Atp6v0d2-/-小鼠接种LLC和B16-F10 肿瘤细胞后，其肿瘤生长更为迅速，并且肿瘤重量明显偏重；ATP6V0d2只在肿瘤相关的巨噬细胞中有表达，而在其他如T细胞，基质细胞以及肿瘤细胞中不表达；巨噬细胞与肿瘤细胞共接种实验揭示Atp6v0d2-/-小鼠BMDMs能够显著促进肿瘤细胞的生长。
3) 肺部成瘤模型结果显示，Atp6v0d2-/-小鼠肺部有更多的肿瘤结节形成，并且 Atp6v0d2-/-小鼠肺组织的巨噬细胞极化的比例明显增加；同时Atp6v0d2-/-小鼠肺部肿瘤中肿瘤细胞的增殖比例明显高于WT组，其肿瘤细胞的凋亡也显著低于WT组。
4) WT和Atp6v0d2-/-小鼠皮下瘤模型结果显示，Atp6v0d2-/-小鼠皮下肿瘤中巨噬细胞极化（ F4/80+CD206+）比例明显增加，但是其炎性巨噬细胞（F4/80+CD11c+）的比例与WT组相比没有差异；并且在肿瘤组织和分离后的TAM中巨噬细胞促肿瘤相关的基因如（Mrc-1,Arg-1,Fizz-1）表达上调，但是炎性相关的基因（Il-1β，Il-6）与WT组相比没有差异；体外用LLC-TCM刺激WT和Atp6v0d2-/-组BMDMs 6h和36h后，Real-time PCR 检测发现， Atp6v0d2-/-小鼠 BMDMs 的促肿瘤相关的基因（Arg-1,Fizz-1）表达显著升高，而其炎性相关的基因（Il-1β，Il-6）的表达与WT组相比没有差异，这与皮下肿瘤模型的结果相一致。
5) 皮下肿瘤模型组织染色发现，Atp6v0d2-/-小鼠皮下肿瘤块中异常血管明显增多，伴随着肿瘤内部坏死区域也显著增加；并且 ELISA 检测发现Atp6v0d2-/-小鼠皮下肿瘤中血管内皮生长因子（ VEGF ）的水平也高于WT组，肿瘤组织以及分选的 TAM 中 Vegf 的基因表达水平也高于 WT组；体外用LLC-TCM刺激WT和Atp6v0d2-/-BMDMs 6h，检测发现Atp6v0d2-/-组BMDMs表达更高的Vegf。
6) 肿瘤组织免疫荧光揭示，Atp6v0d2-/-小鼠皮下肿瘤中巨噬细胞表达更高的HIF-2α，体外一系列蛋白实验发现Atp6v0d2-/-的BMDMs中HIF-2α表达更高，伴随着自噬相关蛋白 P62,LC3 也增加；但 HIF-1α 在 WT 和Atp6v0d2-/-的BMDMs中的表达却没有差异；过表达ATP6V0d2后能够抑制 HIF-2α 的增加，同时 P62，LC3 也相应降低，溶酶体的抑制剂处理WT和Atp6v0d2-/-的BMDMs后，HIF-2α的蛋白水平在两者之间没有明显差异。免疫荧光揭示Atp6v0d2-/-的BMDMs中HIF-2α不能很好的与细胞内溶酶体共定位，但是在WT的HIF-2α能够很好的与溶酶体共定位，说明 Atp6v0d2 敲除后抑制 HIF-2α 的溶酶体降解途径，导致 Atp6v0d2-/-的BMDMs中HIF-2α表达高于WT组。
7) HIF-2α的特异性的抑制剂（PT2385）能够显著抑制WT和Atp6v0d2-/-小鼠皮下肿瘤的生长，并且能抑制异常血管的生成。同时抑制剂的给予能够逆转 Atp6v0d2-/-小鼠肿瘤组织中巨噬细胞促肿瘤相关的基因（Mrc-1,Arg-1,Fizz-1,Ym-1）的上调表达。体外实验发现，LLC-TCM 刺激后的 BMDMs 给予 PT2385 处理后发现，抑制剂能够逆转 Atp6v0d2-/-小鼠 BMDMs 中巨噬细胞促肿瘤相关的基因（Mrc-1,Arg-1,Fizz-1,Ym-1）的上调表达。这与上述肿瘤模型的结果相一致。
8) 临床肺腺癌病人结果发现，HIF-2α 主要表达在 CD68+阳性巨噬细胞中，并且 ATP6V0d2 高表达组的病人中 CD163+巨噬细胞的浸润数目以及HIF-2α的蛋白表达明显低于ATP6V0d2低表达组；同时ATP6V0d2高表达组的病人的生存期也显著高于ATP6V0d2低表达组，HIF-2α低表达组的病人的生存期也显著高于HIF-2α高表达组人。
三．结论
在肿瘤微环境中，肿瘤细胞来源的乳酸通过活化巨噬细胞mTORC1，抑制溶酶体的关键转录因子TFEB的入核，进而特异性下调Atp6v0d2的表达；Atp6v0d2的下调表达抑制HIF-2α的溶酶体降解途径，巨噬细胞的促肿瘤的极化表型增强以及产生的血管内皮生长因子（VEGF）增加进而促进了肿瘤的进展。与此同时，在肺腺癌的临床标本中发现ATP6V0d2的表达与肿瘤内巨噬细胞中HIF-2α的表达以及病人的疾病进展呈负相关。