论文部分内容阅读
目的： 在甲状腺相关眼病(thyroid-associatedophthalmopathy,TAO)患者眼眶脂肪基质细胞(orbitaladipose-derivedstromalcell，OADSC)体外分离和培养的基础上，研究胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor1，IGF-1)对TAO患者OADSC增殖的影响，以及IGF-1在TAO患者OADSC向成熟脂肪细胞分化过程中的作用，并进一步探讨其相关信号传导通路，为深入研究TAO患者眼眶脂肪组织异常增殖的影响因素以及TAO的发病机制提供实验依据，希望有助于为TAO的治疗提供新的思路。 方法： 1.免疫组织化学方法检测IGF-1蛋白在TAO患者和正常人眼眶脂肪组织中的表达。 2.胶原酶消化法分离TAO患者OADSC，并进行原代和传代培养;倒置相差显微镜下观察细胞的形态特征;流式细胞仪检测细胞表面标志物;成脂诱导培养液诱导OADSC细胞向成熟脂肪细胞分化;采用油红O对分化后的细胞进行染色。 3.CCK-8法检测IGF-1对TAO患者OADSC细胞增殖的影响，包括:(1)10ng/mlIGF-1作用于OADSC，检测第1天至第6天细胞生长曲线的变化;(2)不同浓度的IGF-1(0、1、10、20、100、200ng/ml)作用于OADSC，检测72小时后细胞的增殖情况。 4.IGF-1作用于TAO患者OADSC细胞，成脂诱导分化后采用油红O对细胞进行染色;倒置相差显微镜下观察细胞内脂质含量的变化情况，并应用酶标仪对细胞内的脂质含量进行半定量测定。 5.IGF-1作用于TAO患者OADSC，成脂诱导分化10天后，real-timePCR检测成脂标志基因脂联素(adiponectin)、瘦素(leptin)、脂肪酸结合蛋白(adipocytefattyacidbindingprotein，AP2)及脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase，FAS)mRNA水平的变化。 6.Westernblot检测IGF-1作用于TAO患者OADSC1小时后，细胞磷酸化Akt(phosphorylatedAkt，p-Akt)、总Akt蛋白水平的变化;检测IGF-1作用于TAO患者OADSC，成脂诱导分化10天后，促进脂肪生成的重要转录因子—过氧化物酶增殖物活化受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma，PPARγ)蛋白的表达情况。 结果： 1.免疫组织化学检测结果显示:IGF-1蛋白在TAO患者组眼眶脂肪组织中的阳性表达率为26.33％;在正常人组眼眶脂肪组织中的阳性表达率为13.25％。 2.从TAO患者眼眶脂肪组织标本中成功地分离得到了OADSC细胞，并能在体外进行稳定地原代和传代培养;倒置相差显微镜下观察细胞呈长梭形;流式细胞仪检测细胞表面标志物结果显示:CD29(+)、CD44(+)、CD31(-)、CD45(-);成脂诱导培养液诱导分化10天后，细胞内有脂质堆积并能被油红O染为红色。 3.IGF-1(10ng/ml)促进了TAO患者OADSC细胞生长(第2天至第6天，p＜0.05);不同浓度IGF-1作用于TAO患者OADSC细胞72小时后，与对照组相比，1ng/mlIGF-1没有明显地促进细胞增殖（p＞0.05），而10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、200ng/mlIGF-1均促进了细胞增殖(p＜0.01），并且100ng/mlIGF-1对OADSC生长的促进作用最明显(p＜0.05）。 4.三组TAOOADSC细胞成脂诱导分化10天后，油红O染色，酶标仪测定细胞内脂质堆积情况。结果显示:IGF-1组细胞内脂质含量最多，不含IGF-1组细胞内脂质含量最少（较IGF-1组约减少50％），IGF-1+αIR3组细胞内脂质含量居中（较IGF-1组约减少40-45％）。 5.IGF-1作用于TAO患者OADSC细胞成脂诱导分化10天后，real-timePCR检测成脂标志基因mRNA的表达:脂联素、瘦素、脂肪酸结合蛋白、脂肪酸合成酶mRNA分别为对照组的6.8±1.4倍、7.3±0.7倍、2.7±0.7倍和4.0±0.6倍;IGF-1对TAO患者OADSC细胞的这一促进效应能被αIR3（IGF-1受体的阻断性抗体）或LY294002（PI3K信号传导通路特异性抑制剂）显著抑制。 6.IGF-1(10ng/ml)作用于TAOOADSC细胞1小时后，磷酸化Akt(phosphorylatedAkt，p-Akt)蛋白的表达显著上调，但总Akt蛋白的表达无明显变化;IGF-1(10ng/ml)作用于TAOOADSC细胞成脂诱导分化10天后，PPARγ蛋白的表达水平较对照组增高;上述两种效应能均能被αIR3或LY294002所抑制。 结论： 1.IGF-1蛋白在TAO患者组眼眶脂肪组织中的表达水平较正常人组高。 2.应用胶原酶消化法可以分离得到原代TAO患者OADSC细胞，并且能在体外进行稳定地传代培养和扩增，建立供进一步研究的体外细胞模型。 3.通过细胞表面标志物分析提示，TAO患者OADSC细胞是一组间充质来源的细胞;该细胞在成脂诱导培养液的作用下可向成熟脂肪细胞分化。 4.IGF-1能显著地促进TAO患者OADSC细胞增殖和成脂诱导分化，并增加成脂诱导分化后细胞内的脂质堆积。 5.IGF-1经由IGF-1受体(IGF-1R)和PI3K细胞信号传导通路上调PPARγ蛋白的表达，进而促进TAO患者OADSC向成熟脂肪细胞分化;阻断IGF-1R或抑制PI3K细胞信号传导通路可能为治疗TAO提供新的思路。