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病毒需要感染特定的宿主细胞才能完成其复制周期，这个过程需要解决几个关键问题，主要包括入侵、复制、组装和释放。当病毒在宿主细胞内复制时，还面临着宿主细胞的多种免疫压力。要顺利完成复制，病毒还需要逃逸宿主的免疫反应。这些过程都涉及病毒和宿主关键生物大分子间的相互作用，揭示它们相互作用的分子机制对于全面了解病毒的感染、传播和致病机制至关重要，也是预防和治疗相关病毒性疾病的重要理论基础。本论文将介绍针对病毒入侵、组装和免疫逃逸过程中三个重要蛋白和复合体的结构生物学研究。 首先，关注了正黏病毒科内一个独特的类群——Thogotovirus病毒属成员。它们与多种流感病毒等代表性正黏病毒明显不同，与之最为接近的是Quaranjavirus病毒属成员。这类病毒表面只有一个蛋白GP(glycoprotein)负责病毒入侵宿主细胞的整个过程，目前其受体分子仍然未知。研究表明，Thogotovirus GP蛋白与流感病毒的表面蛋白HA(hemagglutinin)，NA(neuraminidase),M2(matrix protein2)和HEF(hemagglutinin-esterase-fusion)都不具有同源性，却与来源于昆虫杆状病毒的表面糖蛋白GP64较为类似。通过结构解析，发现它们都属于Ⅲ型病毒融合蛋白。尽管序列一致性不到30％，但它们整体的三维结构极为相像。经过细致的结构比较和基于其序列的生物信息学分析，认为Thogotovirus GP蛋白与昆虫杆状病毒GP64来源于相同的祖先但在进化中朝着不同的宿主发生了适应性进化。通过比较相关病毒表面蛋白的结构特征和进化地位可以对其致病性、宿主偏好性和跨物种传播能力等作出预测，对于相关病毒性疾病的检测、预防和治疗具有重要的指导作用。 其次，着眼于病毒在细胞内的组装过程，选取埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)的核衣壳体作为研究对象。埃博拉病毒感染能够引起极为严重的出血热症状，具有极强致病性和较高致死率，在历史上曾多次流行并引发了严重疫情。埃博拉病毒属于丝状病毒科(filioviridae），是单股负链RNA病毒的典型代表，其内部具有一个螺旋对称形式的核衣壳体，是病毒基因组复制和转录的模板。埃博拉病毒核衣壳体最主要的蛋白组分是核蛋白NP(nucleoprotein)，它直接与病毒基因组RNA相互作用并对其提供保护。目前埃博拉病毒NP整体结构以及完整的核衣壳体精细结构仍然未知，尤其对于其组装过程更缺乏足够的认识。利用大肠杆菌系统表达了NP△451-739截短蛋白，获得了与之前报道极为类似的类核衣壳体(nucleocapsid-like complex，NLC)颗粒，同时还首次观察到此蛋白形成的约30nm直径的环状颗粒。进一步研究发现，这种环状颗粒能够在体外可逆地组装成螺旋形式的NLC颗粒，这个组装过程对于环境盐浓度较为敏感，且需要RNA参与。通过负染电镜观察，获得了埃博拉病毒NP△451-739蛋白处于不同组装阶段的多种形态的颗粒，并根据理论分析建立了一个NLC颗粒组装过程的模型，为深入了解丝状病毒和其他单股负链RNA病毒的组装机制提供了重要理论参考。 最后，针对病毒对宿主的免疫逃逸现象，对噬菌体编码的anti-CRISPR蛋白抑制其宿主细菌CRISPR-Cas系统的分子机制进行研究。CRISPR-Cas系统是原核生物中广泛存在的一类针对外源核酸和噬菌体感染的免疫系统，对于原核生物的生存具有多方面的作用。为了能够顺利在宿主细菌内建立感染，噬菌体发展了一套精巧的蛋白分子来沉默菌体CRISPR-Cas系统对于自身核酸的免疫作用，这是病毒与宿主共同进化与生存斗争的一个典型例证。聚焦于近年新发现的靶向绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）Type I-F CRISPR-Cas系统的anti-CRISPR蛋白(AcrF1/2)的工作机理展开研究。利用大肠杆菌系统表达和纯化了高纯度和高均一性的Csy复合体与AcrF1/2蛋白组成的核酸蛋白复合物，然后通过冷冻电镜单颗粒三维重构技术进行结构解析。结果显示，此复合体两端柔性较大，重构密度分辨率较差;而由Csy3构成的骨架部分比较稳定，此区域重构密度到达近原子分辨率，并据此成功搭建了原子模型。通过结构分析，发现AcrF1可通过不同的模式与Csy复合体相互作用，并且AcrF1与AcrF2虽然通过不同的位点与Csy复合体结合，但AcrF2与Csy复合体的结合能够影响AcrF1与Csy复合体的结合模式。AcrF1通过与Csy复合体骨架分子Csy3结合干扰了靶标DNA链与crRNA间隔序列的互补配对，从而抑制其识别靶标的能力。AcrF2与Csy复合体尾部区域的结合，能够竞争靶标DNA双链的结合位点，从而抑制Csy复合体与靶标DNA的结合。其中，当AcrF1结合在靠近Csy1-Csy2尾端的Csy3.6位点时，会对AcrF2的结合产生空间位阻从而抑制其结合;由于AcrF2与靶标DNA双链竞争相同的结合位点，因此结合在这一位点的AcrF1分子也可能通过位阻效应抑制靶标DNA的结合。针对这类anti-CRISPR蛋白的研究不仅有助于深入了解CRISPR-Cas系统的生物学功能及工作机制，从而为开发更加精准可控的CRISPR-Cas基因编辑工具提供理论依据;同时这也为应对多种耐药性细菌感染提供了一个全新思路，具有极为广阔的应用前景。 综上所述，针对病毒感染周期中多个阶段的关键生物大分子进行研究，涉及病毒入侵、组装和免疫逃逸等重要生命过程，阐释了相关分子发挥功能的结构基础。这些发现不仅将深化对于病毒与宿主相互作用的了解，更为相关的抗病毒药物研发提供了重要的候选靶点。