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我国慢性乙肝患者约2000万，每年死于晚期肝硬化和肝癌的患者高达50万，是全球晚期肝病发病率最高的地区。目前肝脏移植是作为终末期肝病的主要根治方法，然而由于器官短缺倒置该技术所惠及人群有限。骨髓干细胞肝内移植治疗肝病目前成为实验及临床研究的热点，尤其是干细胞在体内的分化能力和定居、定位情况的研究。传统细胞标记方法的缺陷是需离体状态下进行光镜或/和电镜组织学的检测分析，因此考虑到今后的临床应用，活体检测方法需要深入研究。自从Weissleder于1999年提出分子影像学的概念后，利用分子影像学的方法对移植细胞进行监测成为研究的热点。
目的：
通过多聚赖氨酸（PLL）介导的氧化铁纳米颗粒（SPIO）标记及EGFP慢病毒感染雄性大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行双标记后，经盲肠静脉移植入雌性肝纤维化大鼠，利用磁共振成像（MRI）技术对其进行活体示踪，并采用病理及荧光实时定量PCR检测移植细胞在大鼠体内的分布、迁移和定居情况，评价SPIO—PLL对干细胞的标记及活体示踪效果。
方法：
1.采用密度梯度离心+贴壁法获取雄性大鼠BMSCs，经体外传代、培养、纯化，通过流式细胞仪检测BMSCs细胞表型（CD29、CD45和CD11b）及体外成骨成脂诱导对干细胞进行鉴定。
2.通过慢病毒感染将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因转导入BMSCs基因组，使其持续稳定表达EGFP。
3.采用铁浓度为25μg/mL的SPIO—PLL标记EGFP—BMSCs，电镜观察细胞内铁颗粒，普鲁士蓝染色显示细胞内铁并计算标记率，分光光度计测量细胞内铁含量；通过观察标记后细胞的EGFP荧光情况、MTT测细胞增殖能力、台盼蓝染色测细胞活力、Hoest染色观察细胞凋亡情况、成骨成脂诱导检测细胞多向分化能力等评价SPIO—PLL标记对BMSCs生物学特性的影响。
4.用临床1.5T MR对不同数量级的磁标记细胞行MR扫描，扫描序列包括SE序列T1WI，快速自旋回波（FSE）序列T2MI及梯度回波序列（GRE）T2*WI，观察细胞数量与MR信号变化的关系。
5.腹腔注射四氯化碳建立雌性大鼠慢性肝纤维化模型，通过血清肝功能和肝纤维化生化指标以及病理判断肝纤维化模型的建立。
6.模型大鼠分为A、B、C三组，分别经盲肠静脉注射SPIO—EGFP—BMSCs（4×106 cells）、SPIO2.6μL、EGFP—BMSCs（4×106 cells）。于注射前、注射后1小时、24小时及3、5、7、10、12、15天行MR检查，测量肝脏信噪比（SNR）。
7.分别于细胞移植后24小时及7、15和42天处死两只大鼠，取肝、肺及肾脏本行冰冻切片观察EGFP荧光情况，并行EGFP免疫组织化学及普鲁士蓝染色相互印证。
8.分别取细胞移植后24小时及7、15天和6周大鼠肝、肺、脾、肾、心脏及肌肉组织，提取基因组DNA，通过荧光实时定量PCR检测Sry基因的拷贝数观察移植细胞在体内分布、迁移和定居情况。
结果：
1.第三代BMSCs流式细胞仪检查CD29、CD45和CD11b的结果分别为89.82％、3.69％及2.93％；经成骨成脂诱导后可以在体外被诱导成为脂肪细胞及成骨细胞。
2.EGFP慢病毒感染BMSCs96小时后荧光显微镜下可见EGFP表达，流式细胞仪测定感染率在95％以上。
3.采用铁浓度为25μg/mL的SPIO—PLL标记EGFP—BMSCs后，电镜及普鲁士蓝染色可见胞浆内大量铁颗粒，标记率为97.9％±1.72，标记后细胞存活率为97.8％±0.06，细胞内铁含量为18.38±3.52 pg/cell。SPIO标记对EGFP—BMSCs的EGFP表达、增殖、活力、凋亡及多向分化能力均无影响。
4.体外MRI显示T2*WT序列对标记BMSCs的信号变化最敏感，且随着细胞数量级增大，信号变化逐渐明显，显示信号变化与细胞数量级间存在相关性。
5.造模组大鼠血清血清肝功能和肝纤维化生化指标均明显高于正常和对照组大鼠，肝脏切片病理检查发现肝内纤维组织增生，肝小叶结构紊乱。
6.A组与注射前比较，移植后肝脏SNR明显降低，此后逐渐升高，至15天与移植前相比，差异无统计学意义（P＝0.748>0.05）；B组注射后肝脏信号亦明显减低，但信号恢复较快，至移植后第3天，SNR值与移植前相比差异无统计学意义（P=0.117>0.05）；C组与移植前比较，移植后各时间点SNR值差异无统计学意义。三组间比较时间因素和分组的交互作用有统计学意义（F=27.162，P=0.000<0.05）。
7.细胞移植后24小时，肝、肺内可见EGFP荧光，EGFP免疫组化及铁染色可见大量移植细胞位于肝脏间质内，肺及肾脏也可见到移植细胞分布：细胞移植后7天，肝内可见EGFP荧光，但呈黄绿色，肺内EGFP荧光细胞明显减少，EGFP免疫组化及铁染色可见移植细胞仍主要位于肝脏间质内，肺及肾脏此时较少见到移植细胞；细胞移植后15天及6周，肝内可见EGFP荧光，铁染色可见肝脏内含铁细胞数量随时间进一步减少，肝小叶中发现了不含铁的EGFP免疫组化阳性细胞。
8.细胞移植后24小时六种器官/组织中均有移植细胞分布，到移植后7天，各器官/组织中移植细胞较移植后24小时均有明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；至移植后15天，各器官/组织中移植细胞数较移植后7天从数值上看有所下降，但只有肌肉组织内移植细胞数的减少有统计学差异；至移植后42天，各器官/组织中移植细胞数较移植后15天从数值上看有所下降，但均无统计学差异。
结论：
1.SPIO—PLL标记及EGFP慢病毒感染双标记BMSCs效率高，对细胞生物学特性无影响，可以用于BMSCs的示踪研究。
2.体外MR发现T2*WI序列对信号变化最为敏感，并且信号变化程度与细胞数量级间存在相关性。
3.磁标记BMSCs经盲肠静脉途径移植入肝纤维化模型大鼠体内后，1.5T临床MRI系统可以在一定时段内对其进行监测，但仍不能满足长期监测的要求，尚需进一步研究。含铁细胞随时间进程逐渐减少是MR越来越不敏感的原因。
4.EGFP基因标记的BMSCs在移植后可以用来进行细胞的追踪，示踪时间较MRI更长，但需要进行冰冻切片的荧光观察或EGFP的免疫组织化学病理学检查。
5.经过门静脉移植BMSCs后，于15天及6周在肝小叶内发现不含铁的EGFP的免疫组化阳性细胞，可能是在体内分化、增殖的移植细胞，并且已经迁移到肝实质当中。
6.经过门静脉移植BMSCs后，移植细胞并不全部分布于肝脏，在其他器官/组织中也有分布。但至移植后7天，肝外器官/组织中的移植细胞数会明显减少。肝内的移植细胞数却相对变化较小，可能是由于肝纤维化情况下移植入的细胞部分在肝内定居。
7.单纯通过吞饮作用的SPIO标记BMSCs进行MR活体示踪的效果有限，不仅是监测时间有限，而且不能有效反映移植细胞在体内的分化及增殖情况。
8.盲肠静脉穿刺在肝纤维化大鼠模型中是替代门静脉主干穿刺的一个简单高效的门静脉细胞移植途径。