巴马小型猪成纤维细胞重编程为诱导多能性细胞(iPPC)的研究

来源 :哈尔滨医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yuerenqiu
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目的:至今尚未建立猪胚胎干细胞,对猪多能性细胞的研究知之甚少。本研究尝试将猪成纤维细胞重编程为诱导的猪多能性细胞(induced pig pluripotentcells,iPPCs),目的在于建立、优化猪多能性细胞的培养体系,鉴定该细胞的多潜能状态,在此基础上探索猪多能性细胞向神经谱系细胞特异性分化的能力。  方法:本研究利用逆转录病毒介导的方法,将Oct4,Sox2,K1f4和c-Myc四种人源性转录因子转导入巴马小型猪的胚胎成纤维细胞中,在重编程过程中应用real-time PCR检测不同培养温度及小分子物质对重编程效率的影响,以优化多能性细胞诱导培养条件。经过3周的诱导培养及Oct4病毒的重复感染,建立了形态和特征类似猪上胚层细胞来源的多能性细胞。免疫荧光化学方法检测了多能性细胞标记物,RT-PCR检测了细胞体外三胚层相关基因表达水平,real-time PCR检测了重编程过程中相关多能性基因分子表达的改变,并在全反式维甲酸(RA)和细胞外基质的联合培养下,诱导iPPCs向神经谱系细胞特异性分化。  结果:在经典的Yamanaka4因子的诱导重编程方法的基础上,我们筛选了合适的猪多能性细胞的培养诱导条件,将巴马小型猪胚胎成纤维细胞重编程为iPPCs。研究表明37℃和39℃对重编程的影响无显著差异,而组蛋白乙酰化酶抑制剂VPA可显著促进重编程过程中多潜能基因的表达。Oct4病毒的重复感染能显著上调内源性转录因子的表达水平。所获得的猪iPPCs呈集落样生长,细胞界线不清、核质高,形态类似于猪上胚层细胞。该细胞碱性磷酸酶染色呈阳性;在体外长期传代都保持了正常的染色体核型:表达多潜能性细胞标记分子Oct3/4,Sox2,Nanog,Tra-1-60,Tra-1-81和SSEA-4,并且表达小鼠胚胎干细胞(ES)多潜能性细胞表面分子标记SSEA-1;该细胞体外诱导分化的拟胚体(EB)表达三个胚层分子标记;但是体内分化能力存在缺陷,将该细胞注射到免疫缺陷裸鼠皮下尚未观察到畸胎瘤的出现;维甲酸(RA)及细胞外基质的联合培养可诱导iPPCs向神经谱系细胞分化,诱导后细胞具有神经特异性标志基因Nestin,Tuj1和GFAP的表达。  结论:本次实验应用优化的iPS细胞诱导培养体系建立了诱导的猪多能性细胞(iPPCs),该细胞的建立为今后深入研究猪胚胎干细胞相关特性,促进猪胚胎干细胞系的建立及拓展猪多能性细胞在生物医学和动物生产中的应用奠定基础;此外,我们还建立了猪多能性细胞向神经谱系细胞特异性分化的诱导方案,为神经系统疾病的发病机制研究和药物筛选提供了细胞模型。
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