【摘 要】
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目的:构建pSecTag-OPG真核分泌表达穿梭载体,培养骨保护素(OPG)基因修饰的Cos-7细胞系并检测其表达能力,为基因工程技术治疗牙周病提供基础。 方法:本研究根据编码OPG功能
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目的:构建pSecTag-OPG真核分泌表达穿梭载体,培养骨保护素(OPG)基因修饰的Cos-7细胞系并检测其表达能力,为基因工程技术治疗牙周病提供基础。 方法:本研究根据编码OPG功能蛋白基因序列,设计并合成了特异性寡聚核苷酸引物,提取293细胞的总mRNA,以OPG基因RT产物cDNA为模板,采用DNA聚合酶PCR扩增,克隆具有抑制破骨细胞功能的OPG基因DNA,并将其重组到载体pSecTag2/B中测序:重组质粒经PCR、Hind Ⅲ单酶酶切及EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶酶切鉴定;脂质体法将目的基因转染至Cos-7细胞,并应用免疫组织化学和Western blot方法证实转染的细胞表达骨保护素。 结果:从293细胞的总RNA中反转录扩增得到编码骨保护素的基因片段,重组质粒pSecTag2/B-OPG经PCR、Hind Ⅲ单酶酶切及EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶酶切,电泳显示均能切下与预期大小相符的片段,经测序证实此基因与GenBahk中[gi:33878-056]提供的序列完全一致;免疫组织化学和Western blot方法检测,在转染OPG基因的Cos-7细胞中有OPG表达。 结论:本研究成功构建了pSecTag2/B-OPG分泌表达穿梭载体,并培养出分泌表达OPG的Cos-7细胞系。
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