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在所有水稻病害中,稻瘟病对水稻危害最大,人们对稻瘟病的研究也最深入。随着基因组序列研究的深入和分子遗传工具的应用,水稻与稻瘟病互作已成为研究植物-病原体相互作用的模式系统。然而,在水稻与稻瘟病互作的早期关键阶段,特别是关于水稻防御机制和分子过程,仍不清楚。伴随着蛋白质组学技术的发展,基于iTRAQ的定量蛋白质学已成为研究水稻与稻瘟病互作这一复杂分子过程的有力工具。然而,时至今日,关于稻瘟病菌与水稻互作的蛋白组尚缺乏足够可用的数据。目前,虽然在Pi2/9基因座上已克隆了Pi2、Pi9、Piz-t和Pigm等稻瘟病广谱高抗基因,也已经有人利用分子标记辅助选择技术将该基因座的个别基因应用到育种中;但所用的标记,要么是与目的基因存在一定的遗传距离的SSR标记,要么是不能真实反应基因本体的功能标记;这些标记应用在抗性育种中容易发生错选或漏选,不适合大规模分子育种。另外,由于可用标记的空缺,目前生产中用到的品种和育种材料在Pi2/9基因座的遗传信息,也尚难确定。因此,开发Pi2/9基因座上功能基因特异标记并用于育种具有重要意义。本研究采用基于iTRAQ的蛋白质组学、生物信息学、代谢组学和分子育种学等相结合的方法开展了以下三个方面的研究工作。第一,比较转Piz-t的日本晴材料(Nipponbare-Piz-t)与Piz-t非亲和性菌株KJ201(抗病)、亲和性菌株RB22(感病)反应的差异表达蛋白(Differential expressed proteins,DEPs),通过对比两种互作反应的异同,探索非亲和性反应特异DEPs和两种反应共享DEPs;第二,通过 KJ201-Piz-t(Nipponbare-Piz-t-KJ201)与 KJ201-NPB(Nipponbare-KJ201)和 RB22-Piz-t(Nipponbare-Piz-t-RB22)两种亲和性反应体系DEPs的对比,确定Nipponbare-Piz-t中非亲和性反应与亲和性反应的保守DEPs,然后综合运用代谢组学、rRT-PCR及western-blot等方法验证,第三,通过生物信息学手段开发了Pi2/9基因座上Pi2、Piz-t和Pi9的功能基因特异性分子标记,并利用该基因座的标记或基因对我国434份水稻品种(系)进行了稻瘟病抗性分型和育种实践应用。主要研究结果如下:1、在NPB-Piz-t与KJ201和RB22的反应中,分别检测到118个和119个DEPs。两者共享DEPs 59个,涉及的功能主要有碳代谢和氨基酸代谢、光合作用和碳固定以及RNA降解,它们可能是NPB-Piz-t表达非识别稻瘟病菌效应因子的抗性相关蛋白。在KJ201-Piz-t/CK-Piz-t(Nipponbare-buffer,CK-Piz-t)中,有 59 个特异DEPs,涉及到的功能有TCA、光合作用和天线蛋白、氨基酸代谢和类苯基丙烷合成等其它次生代谢。在RB22-Piz-t/CK-Piz-t中有60个以上调表达为主的特异DEPs,涉及的功能主要有碳代谢、二羧酸代谢,丙酮酸代谢,TCA、氧化磷酸化、亚麻酸代谢和部分次生代谢物合成等。蛋白-蛋白互作(Protein-protein interaction,PPI)网络对比显示表明:两种反应的共享DEPs功能主要表现在24hpi(Hour post inoculation)光系统受到抑制,到48hpi和72hpi加快脂质、糖和能量代谢,并降低共蛋白翻译修饰等功能。KJ201-Piz-t/CK-Piz-t特异DEPs的功能在24 hpi和48 hpi调节修复光合系统和部分生命活动,到72 hpi逐渐恢复光合作用并伴随合成次生代谢物质;而在RB22-Piz-t/CK-Piz-t 中,从 24 hpi 到 72 hpi,特异 DEPs 的功能都是以氧化分解代谢为主。因此,对光系统的修复功能最可能是KJ201-Piz-t非亲和性反应特异表达的调控途径。2、本试验在KJ201-Piz-t/KJ201-NPB中鉴定到93个DEPs,涉及的途径主要有硫代谢、碳固定、卟啉和叶绿素合成、黄酮和黄酮醇合成,精氨酸合成等;在KJ201-Piz-t/RB22-Piz-t中有54个DEPs,主要途径有二羧酸代谢,磷酸戊糖途径、α-亚麻酸代谢,脂肪酸代谢和氨酰tRNA生物合成等。GO(Gene ontology)和PPI对比KJ201-Piz-t/KJ201-NPB 和 KJ201-Piz-t/RB22-Piz-t 都表明:KJ201-Piz-t与两种亲和性反应的特异DEPs差异比较明显,其中KJ201-Piz-t/KJ201-NPB受影响的蛋白点和代谢途径都比较多,这表明了不同亲和性互作系统响应强度的差异。两者有10个属于抗性反应和能量代谢过程的共享DEPs,其中有8个在两组间表达方式一致,它们可能属于参与NPB-Piz-t非亲和性反应的调控蛋白。3、选出 3 个最具代表性蛋白 gi|59800021、gi|20196 和 gi|222637272,综合应用rRT-PCR、代谢组学和Western-Blot等研究方法,分析它们及其相关的蛋白、互作反应和通路在RNA和蛋白(代谢物)的不同层次的表达情况,研究结果表明:gi|59800021和gi|20196在24 hpi和48 hpi的非亲和性反应中,RNA和蛋白质表达水平比在亲和性反应中高;相关于gi|222637272的硫代谢途径途径半胱氨酸(Cysteine,CYS)、S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)和甲硫腺苷(Methylthioadenosine,MTA)等物质在非亲和性反应和亲和性反应的不同时间点的含量具有明显的变化趋势。4、基于Pi9启动子基因座的NBS2的5’UTR序列,参照其等位基因的序列,主要包括Pi2、Piz-t、日本晴以及其它26个代表性品种在该区域的序列特征,开发出9-Pro标记,该标记在Pi9与Pi2Pz-t之间有27 bp的差异,而在Pi9与其它等位基因之间有10 bp的差异。因此,该标记可同时对Pi9和Pi2/z-t进行区分,但不能将Pi2和Piz-t区分开。Pi2和Piz-t间有八个氨基酸的差异,通过比较Pi2、Pi9和Piz-t和日本晴的Pi2及其等位位点,发现了在前六个编码氨基酸的DNA序列间两个可被内切酶PstⅠ和HinfⅠ识别的位点,据此,开发了一个鉴定 Pi2 基因的 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)标记Pi2-LRR。2-LRR-F/2-LRR-R 在Pi2和Piz-t 中分别扩增出 436 bp和439 bp的片断,进一步利用PstⅠ或HinfⅠ酶切PCR产物,能够得到明显差异的片断。上述开发标记及鉴定出的含Pi2和Piz-t的材料,都有经过室内抗性接种验证表明,9-Pro和2-LRR标记在相应抗性基因的F2分离群体中鉴定的结果,与菌株接种鉴定结果一致;含有Pi2和Piz-t的材料的抗性水平也至少等同于相应的阳性对照亲本C101A51和Torid-1。5、将Pi9和Pi2导入到八份优良恢复系中,获得含Pi9和Pi2的改良系。利用19个福建稻瘟菌优势菌株和上杭发病区自然鉴定,结果表明,这些改良系的稻瘟病抗性水平明显得到提高,其中,五个改良系与原亲本相比无明显差异。利用上面开发的9-Pro和2-LRR标记对434份我国重要水稻品种和育种材料进行鉴定,分析结果表明,这些材料中没有含Pi9,但有一份含Pi2和14份含Piz-t的材料;由此说明,这三个抗性基因还未在生产中广泛应用,它们可在今后的抗性育种中值得应用。