论文部分内容阅读
目的：用不同浓度的酒精作用人肝L02细胞，观察细胞的凋亡情况及细胞凋亡过程中细胞的自噬活动，构建并检测具有RNA干扰功能的siRNA，探究酒精诱导肝L02细胞凋亡过程中自噬所起到的作用。 方法：MTT法检测酒精对肝L02细胞生存率的影响；流式细胞术PI单染及AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率；DAPI染色观察细胞核形态改变；吖啶橙染色观察酒精作用后细胞内自噬溶酶体变化；流式细胞术（吖啶橙染色）检测自噬溶酶体显色比例；间接免疫荧光法观察细胞内自噬标志蛋白LC3表达量的变化；蛋白免疫印迹法（Western-Blot）检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3及p62蛋白表达量；Beclin1-siRNA载体的构建与表达检测；检测RNA干扰后对酒精诱导肝L02细胞凋亡与自噬水平变化。 结果：用酒精浓度分别为0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、400mmol/L和800mmol/L的去血清培养基分别处理肝L02细胞12h和24h，对照组含血清不加酒精，与酒精浓度为0mmolL组相比，细胞生存率在12h分别是92.36％、87.91%、73.27%（P＜0.05）、67.72%（P＜0.05）、51.33%（P＜0.01），24h分别是74.85%（P＜0.05）、67.40%（P＜0.01）、47.42%（P＜0.01）、42.35%（P＜0.01）、38.59%（P＜0.01），提示酒精对肝L02细胞具有显著的增殖抑制，且细胞生存率呈现时间和浓度的依赖性；DAPI染色观察细胞核形态，可见随酒精浓度增加细胞数量明显减少并且出现细胞凋亡的特征性改变；流式细胞术AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率，与酒精浓度为0mmolL组相比，在酒精浓度为100mmol/L、200mmol/L、400mmol/L和800mmol/L时，细胞凋亡率分别是13.46%（P＜0.05）、23.28%（P＜0.01）、24.95%（P＜0.01）和17.31%（P＜0.05）；PI单染检测细胞凋亡率，与酒精浓度为0mmolL组相比，在酒精浓度50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、400mmol/L和800mmol/L细胞凋亡率分别为11.19%（P＜0.05）、16.32%（P＜0.05）、37.95%（P＜0.01）、42.37%（P＜0.01）和22.59%（P＜0.01），提示酒精可显著诱导肝L02细胞凋亡；吖啶橙染色结果显示随酒精浓度增加，自噬溶酶体的数量显著增加，用流式细胞术定量检测，与酒精浓度为0mmolL组相比，在酒精浓度为100mmol/L、200mmol/L、400mmol/L和800mmol/L时，吖啶橙显色比例分别是13.86%（P＜0.01）、16.70%（P＜0.01）、17.63%（P＜0.01）和23.11%（P＜0.01），提示随酒精浓度增加细胞自噬程度增强；间接免疫荧光观察自噬体标志蛋白LC3可见，随酒精浓度增高L02细胞内LC3亮度和数量均明显增加；Western-Blot结果显示，不同酒精浓度处理肝L02细胞2h后，Beclin1、LC3和p62的表达量均随酒精浓度增大而增高，较去血清对照组有统计学意义（P＜0.05）；构建Beclin1-siRNA表达载体，RT-PCR显示Beclin1 mRNA明显下调，Western-Blot显示Beclin1蛋白及自噬相关蛋白LC-3和P62的表达量均明显下调，表明Beclin1-siRNA可有效抑制细胞自噬；酒精作用于Beclin1-siRNA处理细胞，可见通过RNA干扰抑制细胞自噬后，酒精诱导L02细胞凋亡率明显增加。 结论：酒精显著降低L02细胞生存率并诱导L02细胞凋亡，酒精诱导L02细胞凋亡过程中有自噬率的上调；酒精诱导L02细胞凋亡过程中细胞自噬对于L02细胞具有保护作用。