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目的 病毒性脑炎（VE）是儿童常见的中枢神经系统（CNS）感染性疾病，引起VE的病原体有很多。近年来，流行病学研究已经表明单纯疱疹病毒（HSV）和肠道病毒（EV）是小儿CNS感染两个最常见的病原。传统的病毒学诊断技术不能及时识别HSV与EV。根据上述情况，我们设计了本研究内容。采用多重逆转录套式聚合酶链式反应（M-RT-nPCR）技术，通过一次套式聚合酶链式反应（nPCR），对VE的主要病原—HSV DNA（包括HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ）及EV RNA（除Echo 22和23型以外的大多数EV）同步检测，旨在建立可靠、准确、快捷、经济的VE病原检测新方法，为临床病毒检测及控制开辟一个崭新的途径。方法 鉴于所要检测的EV系RNA病毒，必须选择包含一个逆转录步骤的多重nPCR方法，因此本研究采用M-RT-nPCR方法。 M-RT-nPCR技术是用一份标本，单管扩增，即在一个反应体系中放入多种引物对，可对多个靶序列进行扩增，同时检测多种病原微生物，它克服了原有检测技术一次操作只能检测一种病毒的局限性。以100例2001年9月至2003年2月间在我院儿科确诊为病毒性脑炎患儿为研究对象，应用M-RT-nPCR对35例<WP=47>ELISA检测阳性脑脊液（CSF）标本进行同步检测，建立病原诊断新方法。再应用M-RT-nPCR对剩余的65例ELISA检测阴性标本进行检测。以同期本科收治的73例非感染脑疾患儿为病例对照组。首先创造一个无RNA酶的环境，然后用异硫氰酸胍一步法提取CSF中RNA及DNA。引物的设计很关键，特异的引物序列设计参照文献。M-RT-nPCR过程如下：逆转录反应体系于37℃孵育60分钟后，于95℃加热5分钟。然后于95℃变性、50℃退火、72℃延伸各45秒，共经30个循环；而在第二次PCR反应中将两种病毒的内套引物全部放入体系中，取第一次扩增产物1ul作为第二次扩增的模板，余组成及反应条件均同第一次扩增。所有的PCR操作均应用PE9600扩增仪。取nPCR扩增产物10ul，在含有溴化乙锭染色的1.5%琼脂糖凝胶上电泳,并置于紫外灯下观察电泳带。为确保实验的可靠性，所有的PCR阳性标本至少试验两次；同时留取CSF标本进行特异性HSV-I IgM及CoxB IgM ELISA检测，并与ELISA及经典nPCR方法做比较。结果 M-RT-PCR整个过程用5小时左右。与ELISA及经典nPCR方法比较,两者的符合率分别达到96%及100%。100例VE中两种病毒总阳性35例，阳性率35%。其中HSV DNA阳性18例（18%），EV RNA阳性17例（17%），P>0.05，两个率比较无差<WP=48>异。在26例重症病脑中HSV 14例（53.85%）, EV 7例（26.92%）， P〈0.05。年龄为0～岁、3～岁、7～14岁患儿分别检测出HSV 2例（7.4%）、5例（11.9%）、11例（35.5%），P〈0.05；检测出EV 7例（25.9%）、8例（19.05%）、2例（6.5%），P〈0.05。结论 M-RT-nPCR是一种能在早期同步检测HSV及EV的可靠的、经济的、快速的病原检测技术，具有广泛临床价值。通过M-RT-nPCR检测证实HSV及EV均为儿童病脑常见病原。在重症病脑中HSV最常见。HSV性脑炎随患儿年龄增长发病率逐渐增高，而EV性脑炎随患儿年龄增长则逐渐降低。