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在体细胞核移植技术中,胞质内全细胞注射法与传统的电融合法相比,具有操作简单、快速等优点,同时也可免去电融合仪这一昂贵的开支,有利于体细胞核移植技术的推广。体细胞核移植技术过程复杂,步骤较多,本研究分析了卵巢保存时间、去核方法和胚胎培养液三个因素对生产克隆胚胎效率的影响,以期获得优化的核移植方法。胚胎质量鉴定无论在临床还是理论上都有重要意义,本研究以前人报道的方法为基础,结合本实验室的实际情况,初步建立了胚胎发育速度评定、核型分析和区分染色的方法,为进一步提高胚胎质量奠定了基础。主要的研究结果如下：1.卵巢保存对体细胞核移植胚胎早期发育的影响该试验包括两部分,第一部分研究了卵巢保存时间对胚胎发育的影响,设立了2h、9h、21h三个组,以2h组为对照组。与对照组相比,卵巢20℃下保存9h不会影响卵母细胞成熟率(64.55% vs. 70.41%,P>0.05)以及克隆胚胎的卵裂率(65.92%vs. 66.11%,P>0.05)和囊胚率(34.09% vs. 37.20%,P>0.05)。当卵巢20℃下保存时间达到21h时,成熟率(42.47% vs. 70.41%,P<0.05)、卵裂率(40.44% vs. 66.11%,P<0.05)和囊胚率(13.60% vs. 37.20%,P<0.05)均显著低于对照组和9h组。结果表明,较长时间的卵巢保存会影响牛卵母细胞体外成熟和体细胞核移植胚胎早期发育,而较短时间(9h)的保存不会影响早期胚胎的形成率。第二部分设计了一个对照组和三个不同保存温度的试验组(4℃,20℃,37℃),对照组采用的是保存2h的卵巢。与对照组相比,37℃下保存明显降低了卵母细胞的成熟率(47.36% vs. 70.41%,P<0.05),而4℃和20℃组与对照组相比,成熟率之间没有显著差异(55.30% vs. 70.41%,64.55% vs. 70.41%,P>0.05)。在卵裂率和囊胚率方面,20℃组显著高于4℃组(65.92% vs. 46.95%,34.09% vs. 25.78%,P<0.05),且与对照组之间没有显著差异；4℃组显著高于37℃组(46.95% vs. 24.46%,27.58%vs. 15.56%,P<0.05)；4℃组和37℃组与对照组均存在显著差异。结果说明较高或较低的温度都不利于卵巢保存,室温或略低于室温的保存温度更适合卵巢的保存。2.去核方法对克隆胚胎早期发育的影响去核方法显著影响体细胞核移植胚胎早期发育,荧光辅助去核法可以显著提高胚胎重构率(83.35% vs. 59.09%,P<0.05)；紫外照射10sec以上,显著降低了胚胎的卵裂率和囊胚率,而照射5sec以下组与盲去法组相比,卵裂率(62.44% vs. 66.93%,P>0.05)和囊胚率(30.63% vs.33.57%,P>0.05)没有显著差异。相比较而言,采用照射5sec以下的荧光辅助去核法更适合本试验研究,因为这种方法不仅简化了操作,而且提高了卵母细胞的利用率。3.胚胎培养液对克隆胚胎早期发育的影响试验随机选取完成激活的重构胚,分别用KSOM和SOF培养,发现囊胚率方面KSOM显著高于SOF组(38.24% vs.30.63%,P<0.05),说明KSOM培养液较SOF更适合体细胞核移植胚胎的早期培养。但是两种培养液的卵裂率没有显著差异(64.21% vs.62.44%,P>0.05)。4.体外胚胎核型分析本研究比较了盲去法和荧光辅助去核法紫外照射小于5sec和紫外照射大于10sec三种情况对胚胎染色体数目的影响,紫外照射10sec以上组的非正常染色体比例(72.33%)显著高于其它两组(39.17%和42.50%),而其它两组没有显著差异(39.17% vs.42.50%,P<0.05)。试验统计了体细胞核移植胚胎染色体变异的总体情况,发现在非正常的染色体中,混倍体(17.95%)和多倍体(12.82%)的情况多于单倍体(7.69%)。试验以传统的经典遗传学方法为基础,加以改进,成功在本实验室建立起胚胎核型分析的方法。5.胚胎的区分染色将完成激活的胚胎随机分为两组分别用KSOM和mSOF培养液培养后比较细胞数目。两种培养液得到的胚胎滋养层细胞数(59.87 vs.74.83,P<0.01)和总细胞数(81.59 vs.100.16,P<0.01)之间均存在显著差异,但内细胞团细胞数之间没有显著差异(P>0.05)。试验以最近报道的较为高效的区分染色方法为基础,加以改进,在本实验室初步建立了该方法。