银杏外种皮中银杏酸的提取纯化、抗菌活性及安全性评价研究

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银杏是我国特有树种也是世界上珍贵的药用植物资源。银杏酚酸存在于银杏外种皮、银杏叶和银杏果中,是一值得研究开发的活性成分,在抗菌杀虫、抗过敏等方面都得到广泛应用。本研究以银杏外种皮为原料,乙醇为提取溶剂,采用加热搅拌提取法从银杏外种皮中提取银杏酸。以银杏酸标准品为对照品,采用高效液相色谱法检测银杏外种皮醇提液中银杏酸的浓度及含量。本研究通过单因素试验和正交试验研究了从银杏外种皮中提取银杏酸的工艺条件;共设置了5个单因素如下:提取次数、提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度;高效液相色谱法检测银杏外种皮提取液中银杏酸的浓度和含量,根据分析得到各单因素的最佳结果。设计正交试验方案并进行试验,通过方差分析以及验证试验得到最佳的提取工艺条件为:提取溶剂85%乙醇,料液比15(W:V),提取温度60℃,提取次数2次,每次提取时间5h。在最佳提取工艺条件下,银杏外种皮醇提掖中银杏酸的得率为8.95%,所得浸膏纯度为33.34%。研究了大孔树脂柱层析对银杏外种皮醇提液中银杏酸的纯化工艺,筛选得到采用D101大孔树脂对银杏酸进行纯化;D101大孔树脂动态吸附与解吸试验结果表明,银杏酸进样液浓度越大越好,进样液流速越小吸附效果越好,进样流速选择1.0mL/min,100%乙醇作为解吸液,洗脱流速选择1.0mL/min,解吸液用量为10倍柱体积(BV),解吸效果较好。采用D101大孔树脂分离纯化银杏酸,所得浸膏中银杏酸的纯度由粗提物中33.34%,提高至80.79%。体外抑菌实验结果表明,银杏外种皮中提取纯化所得银杏酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有体外抑菌作用。其中银杏酸对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好,对金黄色葡萄球菌的抑菌效果次之,对大肠杆菌的抑菌效果最弱。采用二倍稀释法测定银杏酸的最小抑菌浓度,通过实验得出银杏酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为244.90μg/mL、122.45μg/mL和30.62μg/mL。动物体内抗菌实验表明,通过对小鼠皮下注射不同浓度的金黄色葡萄球菌,观察小鼠皮肤感染致炎情况,确定使小鼠皮肤发炎的用菌量,结果表明注射0.1mL1.0×10~8CFU/mL金黄色葡萄球菌后,小鼠皮肤感染致炎发病率100%,临床症状明显,皮肤出现了明显的病理变化,无小鼠死亡现象,成功建立了小鼠金黄色葡萄球菌皮肤感染模型。本研究验证了银杏酸对金黄色葡萄球菌感染皮肤所致炎症的疗效,可使感染动物临床症状明显缓解,皮肤损伤面积缩小,血液中白细胞和淋巴细胞数量明显下降。皮肤病理组织学观察结果表明,银杏酸低剂量组与高剂量组可明显减轻金黄色葡萄球菌致小鼠皮肤感染病变的程度。通过动物急性经皮毒性试验、多次皮肤刺激性试验、皮肤变态反应试验和皮肤光毒性试验,对银杏酸提取纯化液进行了安全性评价研究。银杏酸的急性经皮毒性试验中,采用一次限量法,根据皮肤毒性分级表判断出银杏酸纯化液所用剂量相当于治疗量20倍时有微毒性。银杏酸多次皮肤刺激性试验中,根据皮肤刺激反应评分表得出每只动物的皮肤刺激强度积分均值为1.93,银杏酸纯化液所用剂量相当于治疗量5倍时具有轻刺激性。银杏酸的皮肤变态反应试验中,根据变态反应实验皮肤反应评分表和皮肤致敏强度评价标准,判断出银杏酸纯化液所用剂量相当于治疗量5倍时有轻致敏性。银杏酸的皮肤光毒性试验中,通过皮肤刺激反应评分表可知,银杏酸纯化液所用剂量相当于治疗量5倍时不引起豚鼠皮肤光毒性反应。经皮毒性试验、多次皮肤刺激性试验、皮肤变态反应试验和皮肤光毒性试验结果表明,银杏酸用量在治疗量5倍时,对皮肤具有轻微的刺激性和过敏性,无光毒性。
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