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目的PTSD(post-traumatic stress disorder,创伤后应激障碍)是指由异常威胁性或灾难性心理创伤导致延迟出现和长期持续的精神障碍。其特征性的症状为病理性重现创伤体验、持续性警觉增高、持续性回避、对创伤性经历的选择性遗忘等的临床精神症状,随着自然灾害、重大交通事故、战争、社会暴力和意外事故等的发生,PTSD发生率也越来越高。现今PTSD以其发病率高、病程长、难以治愈等特点,严重影响人们身心健康而备受关注。海马是与学习记忆功能密切相关的重要脑区,而且在营养机能方面也有重要作用,应激选择性的损害海马。有报道,PTSD致海马缩小,那么海马体积的缩小,是否由于海马神经元的凋亡,神经细胞数目减少所致,同时海马体积缩小后其学习记忆功能又将发生什么变化。文献报道,ACP(Acid phosphatase,酸性磷酸酶)活性变化推测可能反应海马神经元损伤的程度。LTP(Long term potentiation,长时程增强)是目前公认理想代表学习记忆功能的电生理指标,为此,我们研究PTSD样大鼠海马神经元凋亡及LTP、ACP的变化,为进一步揭示PTSD的发病机制提供实验依据。实验方法1、实验动物及分组成年健康雄性Wistar大鼠300只,体重220～250g,中国医科大学实验动物中心提供,实验室条件饲养,随机分为五大组,每组60只,分别平均用于AnnexinV-F1TC/PI双标记流式细胞术、透射电镜、ACP组织化学技术,ACP酶电镜、LTP。每组又分为SPS模型建立后的6h、12h、1d、7d、14d组及正常组,每组10只。2、PTSD样大鼠模型的建立采用2005年日本文部省召开的国际PTSD科学学术会议确定的关于PTSD样大鼠模型-SPS刺激后无干扰喂养的方法,SPS刺激是指将大鼠连续进行下述步骤处理:禁锢2h;强迫性游水20min(水深40cm,水温25℃);休息15分钟后乙醚麻醉至意识丧失。3、海马神经细胞的流式细胞术检测分别取正常及经过SPS刺激后6h、12h、1d、7d、14d各组大鼠依次麻醉后开颅取出海马,制成单细胞悬液,加入FITC和PI,上机检测,统计学分析。4、海马神经细胞的透射电镜制样分别取正常及经过SPS刺激后6h、12h、1d、7d、14d各组大鼠依次麻醉后灌流固定,取大鼠海马组织,常规透射电镜制样,倒扣包埋海马CA3区、聚合,半薄切片定位,超薄切片,透射电镜(JEOL 1200EX)80KVT下观察。5、ACP酶组织化学技术与图象分析分别取正常及经过SPS刺激后6h、12h、1d、7d、14d各组大鼠依次麻醉灌流固定取脑,续固定后浸于Holt’S液至沉下。制成14μm厚冰冻切片,Gomori’S法配制孵育液,室温孵育切片90分钟,后光学显微镜(OLYMPUS,BX60,Japan)下观察、摄片,并做图像分析和统计学分析。6、ACP酶电镜细胞化学分别取正常及经过SPS刺激后6h、12h、1d、7d、14d各组大鼠依次麻醉灌流固定取脑,续固定后浸于Holt’S液至沉下。制成40μm厚非冰冻切片,Gomori’S法配制ACP酶孵育液,37℃孵育切片30分钟,常规透射电镜制样,定位海马CA3区倒扣包埋、聚合,半薄切片再定位,AO超薄切片机切片,透射电镜(JEOL 1200EX)80KV下观察拍照。7、电生理检测分别取正常及经过SPS刺激后6h、12h、1d、7d、14d各组大鼠依次麻醉手术开颅植入电极,进行电生理记录,进行统计学分析。结果1、流式细胞术检测结果SPS后6h组与对照组相比,凋亡率升高,SPS后12h凋亡率升高,SPS后1d组凋亡率进一步升高,SPS后7d组与SPS后1d组相比,凋亡率下降,SPS后14d组凋亡率进一步降低。2、透射电镜结果SPS后12h组的部分海马神经元出现核固缩,染色质边集并渐出现新月状改变。SPS后1d组部分神经元形成新月形小体,细胞核膜出现明显的皱折,细胞核开始裂解。3、ACP酶组织化学技术结果低倍镜下整个海马呈现ACP阳性反应,以CA3区反应最为明显,高倍镜下ACP的阳性反应产物呈棕褐色的硫化铅颗粒产物均匀分布在细胞质核周部,延伸到突起:SPS后6h组与对照组相比,ACP的阳性表达增强,SPS后12h阳性表达增强,SPS后1d组ACP的阳性表达进一步增强,SPS后7d组与SPS后1d组相比,阳性表达下降,SPS后14d组阳性表达进一步降低。4、ACP酶电镜细胞化学结果电镜下,在正常对照组神经元,胞质内ACP酶阳性反应产物为高电子密度的黑色磷酸铅沉淀可见圆形溶酶体(spherical lysosome,SLY)、高尔基复合体的板层中均有分布,PTSD后6h组吞噬增强,溶酶体有则由圆形变为线条状(NLT);PTSD后1d组吞噬最强,可见线条状溶酶体(Nematolysosome,NLY);PTSD后7d组可见线状和各种形状的溶酶体在胞质中的分布。5、电生理结果高频刺激(high frequency stimulant,HFS)后,SPS后6h组平均幅值增强率与对照组比较逐渐减小,SPS后12h组更为减小,SPS后1d组时降至最低,SPS后7d组开始回升,SPS后14d组进一步回升。6、图像分析及统计学分析经SPS刺激后,海马神经元凋亡率SPS后6h组较对照组升高,SPS后12h组进一步升高,SPS后1d组升至最高,SPS后7d组凋亡率开始下降,SPS后14d组凋亡率进一步降低(P＜0.05);经SPS刺激后,海马神经元ACP酶阳性表达SPS后6h组较对照组增强,SPS后12h组进一步增强,SPS后1d组升至最高,SPS后7d组阳性表达降低,SPS后14d组阳性表达进一步降低(P＜0.05);经SPS刺激后,海马神经元电生理结果,HFS后,SPS后6h组平均幅值增强率与对照组比较逐渐降低,SPS后12h组进一步减低,SPS后1d组时降至最低,SPS后7d组开始回升,SPS后14d组进一步回升(P＜0.01)。结论1、PTSD样大鼠海马神经元出现细胞凋亡引致神经元数目减少同时ACP酶的增加有利于凋亡产物的清除,由此可解释海马萎缩体积减小。2、PTSD样大鼠海马神经元LTP抑制,提示可能与PTSD所致记忆失常机制相关。