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本研究旨在在细胞、亚细胞及整体动物水平探讨五酯片及其活性成分影响他克莫司药动学的机制，从而为进一步探讨五酯片及其活性成分影响他克莫司药动学行为的分子机制提供实验依据，最终为五酯片及其活性成分与他克莫司的临床联合用药提供理论指导，提高临床用药的有效性、安全性和经济性。
㈠生物样品中他克莫司检测的LC/MS/MS分析方法的建立。建立并验证生物样品中他克莫司的灵敏、特异、可靠的LC/MS/MS分析方法。生物样品采用两步沉淀蛋白后进行乙酸乙酯液—液萃取法抽提或直接采用乙酸乙酯液—液萃取法进行抽提，内标为FK520（Ascomycin）。采用液相色谱—串联质谱方法检测。离子源为电喷雾离子化源（ESI）；检测方式为正离子检测；扫描方式采用多反应监测（MRM），用于定量分析的离子反应分别为m/z821.7→768.9（FK506）和m/z809.8→757.0（FK520）。色谱分析柱为Hypersil BDS C18柱（50 mm×2.1 mm，3μm）；流动相为甲醇—水（含2 mM乙酸铵）（95:5，v/v）；流速为200μL/min；每个样品的分析时间为2 min。分析方法的定量下限为0.5 ng/mL，各生物样品中他克莫司的线性相关程度良好（r2均大于0.99）。以质控样品计算该分析方法的批内精密度RSD在0.8％～13.5％范围内，批间精密度RSD在1.6％～11.3％范围内；方法的准确度在85.8％～106.7％之间；各种生物样品的提取回收率在41.7％～74.3％范围内。各项稳定性考察符合SFDA对分析测定的要求。该分析方法经验证结果满意，样品处理及检测过程快速、可靠，可满足他克莫司临床前药代动力学研究的要求。
㈡五酯片及其活性成分对大鼠体内他克莫司药动学的影响。本研究在前期临床研究的基础上，首先在大鼠体内研究单次灌胃给予五酯片（0.25 g/kg）及其6个木脂素类活性成分（0.024 mM/kg）后对口服他克莫司（1.89 mg/kg）药动学过程的影响。结果显示，与单独服用他克莫司组相比，五酯片及其活性成分和维拉帕米（P—gp抑制剂）均可使口服他克莫司的血药浓度及Cmax（五味子醇甲除外）、AUC升高，均使他克莫司的CL/F及Vd/F降低，但作用程度存在差异，其中五味子醇乙升高他克莫司血药浓度及AUC的作用最强，其次为五酯片。
㈢五酯片及其活性成分对他克莫司在Caco—2细胞模型中吸收的影响。利用Caco—2细胞模型考察五酯片提取物（五酯片的乙醇提取物，以五味子酯甲的浓度表示）及其6个木脂素类活性成分对他克莫司吸收的影响。结果表明五酯片提取物及其活性成分（50，100μM）对他克莫司的吸收促进作用呈浓度依赖性，在浓度为50μM时，五酯片提取物抑制P—gp对他克莫司转运的作用最强（转运率为1.3），但五酯片其它活性成分对他克莫司的转运影响不大；在浓度为100μM时，P—gp阳性对照维拉帕米、五味子甲素、丙素及醇乙使他克莫司的转运率从1.9分别降低至1.5、1.0、1.5及1.3，说明五酯片提取物、维拉帕米、五味子甲素、丙素及醇乙抑制了P—gp介导的他克莫司的外排作用，其中五味子甲素抑制P—gp的作用最强。Caco—2细胞转运实验证实了五酯片、五味子甲素、丙素及醇乙通过抑制肠上皮细胞的P—gp对他克莫司的外排作用而使他克莫司吸收增加，血药浓度升高。
㈣五酯片及其活性成分对体外肝微粒体他克莫司代谢的影响。利用肝微粒体孵育体系考察五酯片提取物及其6个木脂素类活性成分对他克莫司代谢的影响。肝微粒体共孵育实验表明，五酯片提取物及其活性成分（1，10，100μM）抑制他克莫司的代谢作用呈浓度依赖性，100μM的五酯片提取物及五味子醇乙几乎完全抑制了他克莫司在肝微粒体中的代谢。肝微粒体共孵育实验证实了五酯片及其活性成分通过抑制CYP3A对他克莫司的代谢而使他克莫司代谢减少，可能使血药浓度升高，提高了生物利用度。
㈤多次合用五酯片对大鼠体内他克莫司稳态组织分布的影响。考察SD大鼠多次合用五酯片对他克莫司稳态血药浓度及组织分布的影响。大鼠连续合用五酯片及他克莫司4天后，于最后一次给药后12 h处死动物，取各组织器官，制成0.5 g/mL匀浆，取匀浆处理，采用高效液相色谱—串联质谱（LC/MS/MS）方法测定各组织匀浆中他克莫司的浓度。结果显示单独服用他克莫司时各组织的浓度排列顺序为（高→低）：肺>小肠>胸腺>心>肌肉>脾>脂肪>肾>睾丸>脑>肝>血；而合用五酯片组的浓度排列顺序为（高→低）：小肠>肺>心>胸腺>肌肉>脾>脂肪>肾>睾丸>脑>肝>血。连续合用五酯片4天后，他克莫司在各个组织的浓度均高于在全血中的浓度（肝除外），所有组织他克莫司的浓度均比单独服用他克莫司组高，但升高幅度较小，均小于55.9％，且大多数差异不具统计学意义（脾及肌肉除外）。合用五酯片后，即使降低了他克莫司的给药剂量，其稳态血药浓度仍显著高于单独服用他克莫司组。组织分布实验结果提示：在考察期内，合用五酯片可能会使他克莫司在全血中及各个组织中的浓度升高，但各项生化指标表明合用五酯片并未损害大鼠的肝、肾功能。尽管如此，五酯片与他克莫司合用时应尽量减少他克莫司的剂量并且要密切监控其血药浓度，以稳态血药浓度来调整他克莫司的给药剂量。
㈥综上所述，五酯片及其活性成分通过抑制他克莫司的肠及肝首过效应而提高他克莫司的生物利用度，其中抑制肠首过效应是主要原因。肝微粒体实验及Caco—2细胞转运实验证实五酯片及其活性成分对他克莫司药动学的作用源于对CYP3A和P—gp的抑制作用。多次合用五酯片及他克莫司，即使降低了他克莫司的给药剂量，他克莫司的稳态血药浓度仍显著高于单独服用他克莫司组，且其在各个组织中的浓度亦略高于单独服用他克莫司组，但各项生化指标表明合用五酯片并未损害大鼠的肝、肾功能。因此五酯片与他克莫司合用时可减少他克莫司的使用剂量，减少器官移植患者使用昂贵的他克莫司的费用，具有重要的经济价值。