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本课题采用基因拼接(SplicingOverlappingExtension,SOE)的方法,以pComb3H-SS噬粒为载体,构建了一个库容量为4×105的人抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库,从所构建的文库中获得了系列特异性的抗-HBsAg的Fab噬菌体抗体分子并对其进行了基因水平、蛋白质水平的分析鉴定。结果显示,所获得的Fab抗体分子全为人的抗体基因,且只与HBsAg产生特异性反应。从本论文的系列实验中,作者得出如下结论:第一,采用基因拼接方法构建抗体文库可以提高文库的多样性;第二,可以很方便地从库容量较小的免疫抗体文库中获得抗原特异性的人抗体基因。
从乙型肝炎病毒表面抗体高滴度(ELISA1:1024)的供者人全血中分离外周血单个核细胞(PBMC),经RT-PCR分别扩增出全套轻链可变区基因和全套重链可变区基因,再以噬粒pComb3x-TT(为重链CH1及轻链Ck恒定区模板载体)为模板分别扩增出轻链恒定区(Ck)和重链恒定区(CH1)基因,然后分别将全套轻链可变区和轻链恒定区(Ck)基因,全套重链可变区和重链恒定区(CH1)基因进行第一次基因拼接,各自形成全套k轻链和全套Fd重链,再以全套k轻链和全套Fd重链作为模板进行第二次基因拼接,形成完整的全套Fab基因,将全套Fab基因与pComb3H-SS噬粒连接后,电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue(F+),经过多次电穿孔转化,获得总容量为4×105库容的噬菌体抗体库。
采用经国家检定机构检定合格的乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)或纯化的血源乙型肝炎病毒表面抗原作为包被抗原,同时设立BSA和人白蛋白同步筛选对照。
运用酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫荧光实验(IF)、免疫印迹实验(wB)和免疫沉淀实验(IP)等方法进一步对以上噬菌体抗体分子的特异性进行了鉴定。