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帕金森病(PD)是一种慢性进展性神经退行性变导致的运动缺陷性疾病,它以纹状体内多巴胺能神经元的完全或选择性丢失为特征。这一复杂疾病的临床表现主要是运动损伤,包括:静止性震颤,运动迟缓,姿势不稳,蹒跚步态和僵直。目前的治疗只能缓解症状,不能阻止多巴胺能神经元的死亡。神经保护性治疗进展中的主要障碍在于人们对导致多巴胺能神经元死亡的病理过程了解有限。因而研究多巴胺能神经元死亡的病因机制具有重要意义。以往研究表明,DJ-1的功能缺失及突变与常染色体隐性遗传性帕金森病、散发型帕金森病的发生相关。而帕金森病的主要病理特征之一是多巴胺合成分泌减少,酪氨酸羟化酶(TH)作为多巴胺合成的限速酶,直接影响着多巴胺的合成及分泌。本实验室之前已经证实,DJ-1表达水平的改变会影响酪氨酸羟化酶的表达量。Nurrl作为 TH的转录因子,直接调控TH的表达水平,那么DJ-1可否通过Nurrl作用于TH,DJ-1对Nurrl的调节通路中又有哪些信号转导分子的参与,ERK1/2这一重要的信号转导途径是否参与其中,目前都有待明确。
实验选用MN9D细胞系,为小鼠源性杂交瘤细胞。利用人工合成microRNA(miRNA)作为基因干扰工具,在MN9D细胞系中建立DJ-1敲减的细胞模型。实验对象分为正常对照组(N),DJ-1基因干扰组(分别转染三个干扰片段R1、R2、R4),干扰无关序列对照组(Control),以及恢复实验组(共转染干扰片段R4和野生型DJ-1)。在实验细胞中瞬时转染后,24h、48h、72h分别提取全细胞RNA、全细胞蛋白质、全细胞Luciferase裂解样品及高压液相裂解样品。首先应用real-time PCR,蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western blot)的技术方法,观察miRNA对DJ-1的干扰效果,分别以正常非处理组和干扰无关序列组作对照；确定DJ-1敲减的细胞模型成功建立后,再用real—time PCR,蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western blot)、Luciferase双荧光报告系统观察DJ-1对TH表达水平、ERK1/2信号通路中相关分子的影响,以及Nurrl在DJ-1调节TH表达中的作用；最后通过高压液相的方法观察DJ-1敲减后多巴胺合成及分泌水平的变化。实验数据通过One way ANOVA或t-test进行统计学检验,以均数±标准误(X±S.E.)表示,其中p<0.05具有显著性。实验结果如下:
1.在MN9D细胞系中瞬时转染miRNA,可以高效干扰目的基因DJ-1的表达。
转染干扰片段的R1、R2、R4实验组与干扰无关序列的对照组相比,目的基因DJ-1表达水平明显下调。提取干扰24h的全细胞RNA经real-time PCR检测,结果显示:DJ-1干扰组的mRNA水平明显下调,R1、R2、R4各组较干扰无关序列对照组分别下降85％、90％、95％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)。说明miRNA在转录水平上有效干扰了目的基因的表达。提取DJ-1干扰24h、48h、72h的全细胞蛋白,经Western blot检测,结果显示:干扰24h和48h后DJ-1的蛋白表达水平也明显下调,干扰72h后无明显变化。其中24h组,R1、R2、R4各组较干扰无关序列对照组分别下降75％、75％、85％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)；48h组,R1、R2、R4各组较干扰无关序列对照组分别下降70％、75％、80％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)。说明miRNA有效干扰了目的基因DJ-1的蛋白表达水平,并且这种干扰作用在24h和48h两个时间点上效率较高,在72h干扰作用基本消失。
2.DJ-1干扰后下调酪氨酸羟化酶(TH)的表达水平。
Real—time PCR半定量分析结果显示:DJ-1干扰24h后,酪氨酸羟化酶(TH)的mRNA表达水平较对照组明显下调,R1、R4两组分别较无关序列对照组下调60％、70％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)。随后通过Western blot定量分析结果显示:DJ-1干扰后,酪氨酸羟化酶(TH)的蛋白表达水平下调。干扰24h后,R1、R2、R4各组TH表达量较无关序列对照组分别下调40％、35％、55％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)；干扰48h后,R1、R2、R4各组 TH表达量较无关序列对照组分别下调55％、45％、65％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)。恢复实验显示:转染干扰片段R4的同时过表达野生型DJ-1,可以挽回DJ—1干扰后对TH表达量的下调作用。进一步说明 TH表达水平的变化是由DJ-1干扰所引起的。
3.DJ-1干扰后通过Nurrl调节酪氨酸羟化酶(TH)的表达。
Real—time PCR半定量分析结果显示:DJ-1干扰24h后,Nurrl的的mRNA表达水平较对照组明显下调,R1、R4两组分别较无关序列对照组下调65％、70％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)。随后通过Western blot定量分析结果显示:DJ-1干扰后,Nurrl的蛋白表达水平下调。干扰24h后,R1、R2、R4组 TH表达量较无关序列对照组分别下调60％、70％、85％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)；干扰48h后,R1、R2、R4组Nurrl表达量较无关序列对照组分别下调85％、90％、95％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)。说明DJ-1干扰后影响了Nurrl这一转录因子的表达。接下来通过Luciferase双荧光报告系统检测到:DJ-1干扰后TH转录启动水平较干扰无关序列对照组下降60％,共转染干扰片段R4和野生型Nurrl时,TH转录启动水平可以恢复,甚至高出对照组,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)。说明DJ-1可以通过Nurrl发挥对TH的转录调节作用。
4.ERK1/2信号转导通路参与DJ-1对Nurrl的调节。
Western blot定量分析结果显示:DJ—1干扰后,ERK1/2的磷酸化水平下降。干扰24h后,R1、R2、R4组磷酸化ERK1/2表达量较无关序列对照组分别下调50％、40％、60％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)；干扰48h后,R1、R2、R4组磷酸化ERK1/2表达量较无关序列对照组分别下调50％、65％、80％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)。接下来再用Western blot定量分析结果显示:DJ-1干扰后,MEK1/2的磷酸化水平下降。干扰24h后,R1、R4.组磷酸化MEK1/2表达量较无关序列对照组分别下调60％、75％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)；干扰48h后,R1、R4组磷酸化MEK1/2表达量较无关序列对照组分别下调80％、95％,差异具有统计学意义(p<0.05,n=3)。同时通过恢复实验证实:共转染干扰片段R4和野生型DJ-1,可以逆转DJ—1干扰后对MEK1/2磷酸化水平的下调,说明ERK1/2信号转导通路的变化是受DJ-1调节的。
5.DJ-1干扰后多巴胺能细胞MN9D的多巴胺合成分泌水平下降。
高压液相色谱分析法结果显示:在MN9D细胞中瞬时转染miR1,miR4,control,WT-DJ-1,并共转染WT-DJ-1和miR424h后用HPLC裂解液取全细胞多巴胺、多巴克和高香草酸。配成高氯酸浓度为0.1％的样品,通过高压液相电生理方法检测MN9D细胞中多巴胺合成水平的变化。得到样品检测数值后,分别除以各组样品的细胞计数,得到的结果可用于统计学分析。结果显示:标准品检测成功,多巴胺、多巴克及高香草酸均有特异性峰值；说明仪器及检测系统运行正常,可以用于检测样品。另有多巴胺、多巴克及高香草酸标准曲线,说明样品中三者含量与上样量成正比。各样品组均检测到特异性峰值,多巴胺以及高香草酸和多巴胺的比值,与预期趋势相符合,即这两项指标均随DJ-1的敲减和过表达呈现出相应的变化趋势。但多巴克与多巴胺的比值,各组间未见明显差异。