论文部分内容阅读
原发性肝癌是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一，尽管近年来多种治疗技术的发展极大改善了肝癌患者的预后，其致死率依旧很高，在男性癌症相关死亡原因中高居第二位，在女性中位居第六位。目前人们对肝癌发生发展的具体机制并不十分清楚，缺乏肝癌早期诊断的有效手段，因此，深入对肝癌发生过程中关键分子调控机制的研究对于肝癌的早期诊断和治疗尤为重要。
研究表明肝癌细胞和早期胎肝细胞具有很多相似的特征，某些表达胎肝特异性转录因子和信号分子的肝癌亚型与不良预后有关。癌胚蛋白通常在胎肝中表达，在成年肝脏中沉默，在肿瘤发生过程中有重要作用，具有一定的临床应用价值。
为了找到可能在肝癌的生物学过程中发挥重要作用的癌胚蛋白，我们通过芯片检测了胎鼠和成年小鼠肝脏以及小鼠DEN诱导的肝癌中mRNAs的表达谱。我们鉴定了许多胎肝特异性和肝癌特异性mRNAs，并通过重叠以上结果鉴定了一些感兴趣的癌胚mRNAs，发现Ube2c分别在小鼠胎肝和DEN诱导的肝癌样本中高表达。在人胎肝和肝癌样本中也证实了相同的结果。
在胎肝和肝癌样本中发现UBE2C强烈提示我们，该基因具有癌胚特性，很可能在肝癌的生物学过程中发挥重要作用，包括肝癌发生、发展和转移。进一步的临床样本检测结果显示，UBE2C在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且UBE2C高表达提示患者更差的预后。随后我们构建了稳定过表达UBE2C和稳定敲低UBE2C的肝癌细胞系，并进行了一系列体内外功能学实验。通过CCK-8测定、EdU实验、克隆形成和流式细胞仪检测细胞周期，我们发现，过表达UBE2C可以显著促进肝癌细胞的体外增殖和存活，而干扰UBE2C则显著抑制肝癌细胞的增殖；TUNEL实验和流式细胞仪检测细胞凋亡显示，过表达UBE2C能够明显抑制肝癌细胞的凋亡，而干扰UBE2C则促进肝癌细胞凋亡；Transwell迁移实验和划痕实验显示，过表达UBE2C可以显著促进肝癌细胞的迁移能力，而干扰UBE2C则抑制其迁移；通过裸鼠腋下荷瘤实验，我们发现过表达UBE2C能够明显促进肝癌细胞在体内的增殖和存活。随后，我们进行了机制研究，通过质谱检测可能与UBE2C结合的底物蛋白，并对质谱鉴定结果进行筛选，发现β-tubulin可能是UBE2C的相互作用分子。通过进一步的生物信息学分析和蛋白质免疫共沉淀实验，我们初步证实UBE2C可与β-tubulin相互结合，利用细胞免疫荧光实验，进一步明确了UBE2C与β-tubulin的相互作用。为了进一步验证UBE2C与β-tubulin的关系，我们通过Real-timePCR和Westernblot检测β-tubulin在稳定过表达UBE2C的肝癌细胞中的表达，发现UBE2C在蛋白水平上下调β-tubulin的表达。通过放线菌酮实验和β-tubulin在肝癌细胞中的泛素化水平检测，发现UBE2C与β-tubulin结合，可以促进其泛素化降解。双荧光素酶报告基因实验和“Rescue实验”证实，UBE2C是通过β-tubulin激活Wnt信号通路，从而促进肝癌细胞的增殖和转移。
本研究从“癌胚性”入手，在芯片检测中发现Ube2c在小鼠胎肝和肝癌组织中特异性高表达，提示UBE2C可能参与调控早期肝发育和肝癌的发生发展。为此本课题以UBE2C为首要研究目标，分析了其表达水平与肝癌临床病理特征之间的关联，以及对肝癌发生发展过程中的生物学功能的影响，探究了UBE2C在肝癌中的调控机制，为临床肝癌的早期诊断和治疗奠定了理论基础。
研究表明肝癌细胞和早期胎肝细胞具有很多相似的特征，某些表达胎肝特异性转录因子和信号分子的肝癌亚型与不良预后有关。癌胚蛋白通常在胎肝中表达，在成年肝脏中沉默，在肿瘤发生过程中有重要作用，具有一定的临床应用价值。
为了找到可能在肝癌的生物学过程中发挥重要作用的癌胚蛋白，我们通过芯片检测了胎鼠和成年小鼠肝脏以及小鼠DEN诱导的肝癌中mRNAs的表达谱。我们鉴定了许多胎肝特异性和肝癌特异性mRNAs，并通过重叠以上结果鉴定了一些感兴趣的癌胚mRNAs，发现Ube2c分别在小鼠胎肝和DEN诱导的肝癌样本中高表达。在人胎肝和肝癌样本中也证实了相同的结果。
在胎肝和肝癌样本中发现UBE2C强烈提示我们，该基因具有癌胚特性，很可能在肝癌的生物学过程中发挥重要作用，包括肝癌发生、发展和转移。进一步的临床样本检测结果显示，UBE2C在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且UBE2C高表达提示患者更差的预后。随后我们构建了稳定过表达UBE2C和稳定敲低UBE2C的肝癌细胞系，并进行了一系列体内外功能学实验。通过CCK-8测定、EdU实验、克隆形成和流式细胞仪检测细胞周期，我们发现，过表达UBE2C可以显著促进肝癌细胞的体外增殖和存活，而干扰UBE2C则显著抑制肝癌细胞的增殖；TUNEL实验和流式细胞仪检测细胞凋亡显示，过表达UBE2C能够明显抑制肝癌细胞的凋亡，而干扰UBE2C则促进肝癌细胞凋亡；Transwell迁移实验和划痕实验显示，过表达UBE2C可以显著促进肝癌细胞的迁移能力，而干扰UBE2C则抑制其迁移；通过裸鼠腋下荷瘤实验，我们发现过表达UBE2C能够明显促进肝癌细胞在体内的增殖和存活。随后，我们进行了机制研究，通过质谱检测可能与UBE2C结合的底物蛋白，并对质谱鉴定结果进行筛选，发现β-tubulin可能是UBE2C的相互作用分子。通过进一步的生物信息学分析和蛋白质免疫共沉淀实验，我们初步证实UBE2C可与β-tubulin相互结合，利用细胞免疫荧光实验，进一步明确了UBE2C与β-tubulin的相互作用。为了进一步验证UBE2C与β-tubulin的关系，我们通过Real-timePCR和Westernblot检测β-tubulin在稳定过表达UBE2C的肝癌细胞中的表达，发现UBE2C在蛋白水平上下调β-tubulin的表达。通过放线菌酮实验和β-tubulin在肝癌细胞中的泛素化水平检测，发现UBE2C与β-tubulin结合，可以促进其泛素化降解。双荧光素酶报告基因实验和“Rescue实验”证实，UBE2C是通过β-tubulin激活Wnt信号通路，从而促进肝癌细胞的增殖和转移。
本研究从“癌胚性”入手，在芯片检测中发现Ube2c在小鼠胎肝和肝癌组织中特异性高表达，提示UBE2C可能参与调控早期肝发育和肝癌的发生发展。为此本课题以UBE2C为首要研究目标，分析了其表达水平与肝癌临床病理特征之间的关联，以及对肝癌发生发展过程中的生物学功能的影响，探究了UBE2C在肝癌中的调控机制，为临床肝癌的早期诊断和治疗奠定了理论基础。