论文部分内容阅读
细胞分裂素（CTK）作为一类腺嘌呤衍生物，是参与调控植物生长发育过程最重要的植物激素之一，目前已被研究证实有许多重要的生理功能，如促进植物细胞分裂分化、延缓衰老、提高籽粒产量、调控非生物胁迫等，能够被细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(Cytokinin Oxidase/Dehydrogenase,CKX)不可逆降解，且具有很强的专一性。小麦作为世界三大作物之一，是中国主要的粮食来源，研究小麦CKX基因的功能对培育高产、优质、适应性强的小麦品种、优化小麦种质资源和国家粮食安全具有极其重要的意义。本研究基于实验室前期构建的济麦22号TILLING突变体库，在其全外显子捕获测序数据库中查找了TaCKX4、TaNAC1基因的有效突变位点并进行鉴定，对鉴定成功的部分突变株系进行了多个生理指标和CKX相关基因表达量的分析，初步分析并比较了各突变株系的生理功能和性状，总结了TaCKX4和TaNAC1基因的调控关系。同时，本研究还基于实验室前期构建并优化的HRM突变体筛选体系，以TaCKX1为目的基因，进行了筛选应用。主要实验结果如下：
1.济麦22号小麦TILLING突变系TaCKX4、TaNAC1基因突变位点的检测
为研究小麦TaCKX4、TaNAC1基因的功能，在本实验室构建的济麦22号TILLING突变群体全外显子捕获测序数据库中查找对应的突变株系，共获得6个TaCKX4突变株系和8个TaNAC1突变株系，通过进一步分析检测，成功鉴定出4个TaCKX4突变株系和6个TaNAC1突变株系，均存在G→A和C→T的单碱基突变位点。为进一步分析小麦TaCKX4、TaNAC1基因突变对小麦生长的影响以及研究小麦CKX基因功能奠定了基础。
2.TaCKX4、TaNAC1突变体生理功能分析和基因表达分析
选取实验前期鉴定成功的部分突变株系（JM58、JM73、JM105、JM108、JM112和JM286）分别进行生理指标和基因表达量的分析，并与野生型JM22进行比较。分别用0、2、4、6mmol/L硫酸锌溶液处理不同突变株系的小麦幼苗，并测定其根长势、植株高度、叶绿素含量、根细胞活力后发现：不同浓度硫酸锌对小麦根长势、植株高度的影响为高浓度促进、低浓度抑制的趋势，且高浓度硫酸锌（6mmol/L）对JM112和JM286影响较为明显；叶绿素含量呈现随硫酸锌溶液浓度增加逐渐下降的趋势，且2mmol/L硫酸锌溶液处理下叶绿素含量有增加的可能，同时发现突变株系JM73、JM108在无硫酸锌溶液处理时相比其他株系所含的基础叶绿素含量较高；低浓度硫酸锌溶液（0、2mmol/L）处理对小麦根细胞活力的影响不大，且JM58、JM73和JM108相比其他株系根细胞活力更好。分别用0%、20%、30%、40%PEG处理不同突变株系的小麦幼苗一周左右，并测定其PSⅡ最大光合效率（FV/Fm）、光化学淬灭系数（qp）、PSⅡ实际光合效率（Y（Ⅱ））后发现：FV/Fm、qp、Y（Ⅱ）在重度PEG干旱胁迫（40%）下降幅最明显，大致趋势为随PEG干旱胁迫浓度的增加荧光参数下降，JM22和JM286的荧光动力学参数降幅不显著，抗旱性能良好。重度干旱胁迫（40%PEG）处理不同突变株系的小麦幼苗，并分析其在0、0.5、1、2、12h时TaNAC1和TaCKX4等基因的表达量变化后发现：在受到重度干旱胁迫的12h内，所有小麦株系的TaNAC1基因表达量均轻微下调后恢复正常水平，TaCKX4和TaCKX5基因表达量则明显上调。通过以上生理指标和基因表达量分析初步发现野生型JM22、突变株系JM73和JM105等有较好的抗旱性，可以作为改良小麦种质资源的品系继续发掘其潜力。
3.HRM筛选突变体平台的初步应用
基于实验室前期建立并优化的HRM突变体筛选平台，以小麦产量性状相关的TaCKX1为目标基因，对随机选取的8个济麦22号TILLING突变株系进行筛选，分别成功地在7A019和7A106突变株系中筛选出G→A和A→G的单碱基突变。利用HRM突变体筛选平台对TaCKX1基因的筛选应用，验证了该平台的运行情况，为后续筛选TILLING突变体库的其他基因提供了技术支持。
1.济麦22号小麦TILLING突变系TaCKX4、TaNAC1基因突变位点的检测
为研究小麦TaCKX4、TaNAC1基因的功能，在本实验室构建的济麦22号TILLING突变群体全外显子捕获测序数据库中查找对应的突变株系，共获得6个TaCKX4突变株系和8个TaNAC1突变株系，通过进一步分析检测，成功鉴定出4个TaCKX4突变株系和6个TaNAC1突变株系，均存在G→A和C→T的单碱基突变位点。为进一步分析小麦TaCKX4、TaNAC1基因突变对小麦生长的影响以及研究小麦CKX基因功能奠定了基础。
2.TaCKX4、TaNAC1突变体生理功能分析和基因表达分析
选取实验前期鉴定成功的部分突变株系（JM58、JM73、JM105、JM108、JM112和JM286）分别进行生理指标和基因表达量的分析，并与野生型JM22进行比较。分别用0、2、4、6mmol/L硫酸锌溶液处理不同突变株系的小麦幼苗，并测定其根长势、植株高度、叶绿素含量、根细胞活力后发现：不同浓度硫酸锌对小麦根长势、植株高度的影响为高浓度促进、低浓度抑制的趋势，且高浓度硫酸锌（6mmol/L）对JM112和JM286影响较为明显；叶绿素含量呈现随硫酸锌溶液浓度增加逐渐下降的趋势，且2mmol/L硫酸锌溶液处理下叶绿素含量有增加的可能，同时发现突变株系JM73、JM108在无硫酸锌溶液处理时相比其他株系所含的基础叶绿素含量较高；低浓度硫酸锌溶液（0、2mmol/L）处理对小麦根细胞活力的影响不大，且JM58、JM73和JM108相比其他株系根细胞活力更好。分别用0%、20%、30%、40%PEG处理不同突变株系的小麦幼苗一周左右，并测定其PSⅡ最大光合效率（FV/Fm）、光化学淬灭系数（qp）、PSⅡ实际光合效率（Y（Ⅱ））后发现：FV/Fm、qp、Y（Ⅱ）在重度PEG干旱胁迫（40%）下降幅最明显，大致趋势为随PEG干旱胁迫浓度的增加荧光参数下降，JM22和JM286的荧光动力学参数降幅不显著，抗旱性能良好。重度干旱胁迫（40%PEG）处理不同突变株系的小麦幼苗，并分析其在0、0.5、1、2、12h时TaNAC1和TaCKX4等基因的表达量变化后发现：在受到重度干旱胁迫的12h内，所有小麦株系的TaNAC1基因表达量均轻微下调后恢复正常水平，TaCKX4和TaCKX5基因表达量则明显上调。通过以上生理指标和基因表达量分析初步发现野生型JM22、突变株系JM73和JM105等有较好的抗旱性，可以作为改良小麦种质资源的品系继续发掘其潜力。
3.HRM筛选突变体平台的初步应用
基于实验室前期建立并优化的HRM突变体筛选平台，以小麦产量性状相关的TaCKX1为目标基因，对随机选取的8个济麦22号TILLING突变株系进行筛选，分别成功地在7A019和7A106突变株系中筛选出G→A和A→G的单碱基突变。利用HRM突变体筛选平台对TaCKX1基因的筛选应用，验证了该平台的运行情况，为后续筛选TILLING突变体库的其他基因提供了技术支持。