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【研究背景】 在分化的体细胞中过表达特定的转录因子可将其重编程为多能性干细胞。通过这种方法建立的病人特异性多能干细胞(Induced pluripotent stem cell,iPS),避免了移植产生的排斥反应,且绕开了胚胎干细胞因破坏胚胎所带来的伦理学问题。转分化可将一种终末分化细胞转分化为另一种终末分化细胞,通过在体细胞中强制性表达外源基因可将其直接转化为包括神经元在内的多种细胞类型。 婴儿期严重肌阵挛性癫癎(SMEI,也被称为Dravet综合征)和全面性(遗传性)癫癎伴热性惊厥附加症(GEFS+)两者都可以由SCN1A基因的突变引起,该基因编码NaV1.1电压门控钠通道的α1亚基。GEFS+的疾病频谱包括了轻度至重度一系列的表型,其中最严重的表现是严重高热惊厥综合征,即Dravet综合症(也称SMEI)。目前对于SMEI确切的致病机理尚不清楚,且没有有效治疗药物。此外,一些常规抗癫癎药物的使用还可导致其病情加重。 【研究目的】 通过iPS技术及转分化技术对Dravet综合症患者进行体外建模,初步探讨发病机理,并进行初步药物筛选。 【材料与方法】 本研究通过两种途径将病人的成纤维细胞转变为成熟的神经元:一是通过将病人的成纤维细胞重编程为多能性干细胞,体外将其分化为成熟的神经元;二是将病人的成纤维细胞直接转分化为成熟的神经元。 1.通过将OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC四种转录因子导入Dravet综合症及GEFS+病人的成纤维细胞中,建立了30多株细胞系,并通过免疫荧光染色,核型分析,畸胎瘤实验及芯片分析等鉴定其多能性。 2.将Dravet综合症,GEFS+病人及正常对照组hES体外定向分化为成熟的谷氨酰胺能及GABA能神经元,并通过免疫荧光染色及电生理活动等方法进行鉴定。 3.通过在病人的成纤维细胞中过表达六种转录因子(ASCL1、BRN2、MYT1、NEUROD1、OLIG2和ZIC1)成功将其直接转分化为谷氨酰胺能及GABA能神经元,并进行免疫荧光染色及Na通道活动等电生理检测。 4.通过免疫荧光染色发现,在体外分化的神经元中,90％以上都是谷氨酰胺能神经元,其余为GABA能神经元;大部分转分化的神经元也都是谷氨酰胺能神经元,少数为GABA能神经元。 5.通过生物素(Biocytin)标记电生理记录过的神经元,并通过免疫荧光分析发现,所记录的神经元都为谷氨酰胺能的神经元。 【结果】 1.成功的建立了Dravet综合症及GEFS+病人的iPS细胞系,通过免疫荧光染色发现其可表达OCT4,SOX2,TRA-1-60。畸胎瘤实验发现Dravet综合症及GEFS+病人的iPS细胞形成的畸胎瘤可分化为三个胚层。核型检测发现病人的iPS都具有正常核型。基因芯片结果分析发现病人的iPS细胞系基因表达与人类胚胎干细胞类似。 2.成功的将Dravet综合症及GEFS+病人的iPS细胞系体外定向分化为成熟的且有功能的谷氨酰胺能神经元。这些神经元可表达神经元的标志物TUJ1,MAP2,GAD67,vGLUT1及SYNAPSIN,并通过电生理检测发现其具有Na、K电流,动作电位及兴奋性突触后电流(mEPSC)。 3.通过检测其Na通道活动发现,Dravet综合症病人体外分化的神经元Na电流变大,Na通道失活延迟,动作电位强度及频率明显增强,具有自发性癫癎样放电及阵发性去极化偏移(PDS)。 4.通过将抗癫痫药物苯妥英钠处理Dravet综合症病人iPS体外分化神经元发现,其Na电流变小,动作电位强度及频率减小,自发性阵发性去极化偏移现象消失,在一定程度上缓解其Na通道的过度兴奋性。 5.成功的将Dravet综合症及GEFS+患者的成纤维细胞在体外直接转分化为成熟的且有功能的神经元,这种神经元可表达神经元的标志物TUJ1,MAP2,GAD67,vGLUT1及SYNAPSIN,并通过电生理检测发现其具有Na、K电流,动作电位。 6.通过电生理功能检测发现Dravet综合症患者直接转分化神经元,发现其Na通道失活延迟,这与iPS体外分化神经元的病理表型相一致。 【结论】 1.建立了Dravet综合症及GEFS+病人的诱导型多能干细胞系,并将其定向分化为成熟且有功能的神经元。 2.通过转分化技术将Dravet综合症及GEFS+病人的成纤维细胞直接转分化为成熟且有功能的神经元。 3.利用iPS技术及转分化技术建立了Dravet综合症及GEFS+疾病模型。 4.利用iPS体外分化的神经元进行了初步药物筛选,为将来的大规模的药物筛选提供了一定的实验基础。