拟南芥氰酸盐裂解酶(AtCYN)生化分析以及功能研究

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氰酸盐是一种毒性物质,它的毒性表现有两个方面:一是通过对蛋白质等生物活性分子的氨基甲酰化,使各种生物分子丧失正常的生理功能;二是影响体内的精氨酸合成通路,干扰氨基酸的合成。氰酸盐裂解酶(Cyanase)在大肠杆菌和蓝藻中被深入研究,它的功能为催化氰酸盐和碳酸氢盐的反应,将氰酸盐分解为铵和二氧化碳,既除去了有毒的氰酸盐,也为细菌提供氮源(铵)和碳源(二氧化碳)。大肠杆菌中Cyanase的晶体结构被解析,有活性的酶是同源十聚体结构,活性中心包含了3个关键氨基酸。Cyanase的同源基因在动物界以外的多个物种的基因组中被发现。植物中也报道发现了CYN基因,但是对于植物中的氰酸盐裂解酶的生化性质和生理功能一直没有报道。在本文的研究中,我们克隆了拟南芥和水稻的CYN基因。通过原核表达纯化得到有催化活性的Cyanase,凝胶过滤层析证明它们是同源十聚体构成的;氨基酸点突变发现了拟南芥Cyanase形成同源十聚体结构和催化活性的关键氨基酸残基;在烟草瞬时表达系统里用CoIP方法证明拟南芥和水稻cyanase都有自身相互作用。我们发现野生型拟南芥对一定浓度的氰酸盐能够耐受,而cyn突变体拟南芥对氰酸盐敏感;我们得到的回复突变的转基因植物能够回复对氰酸盐的耐受表型。拟南芥CYN基因在花中的表达水平高于其他组织。氰酸盐胁迫并不会提高CYN基因的表达,而是在胁迫发生的初期降低CYN的表达。拟南芥和水稻CYN的GFP融合蛋白在烟草表皮细胞中呈现点状分布。
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