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胃癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。普通型胃腺癌伴神经内分泌分化,是指胃腺癌中出现分化的神经内分泌(NE)细胞,但其数目在癌组织成分中所占比例较小,不足50%,并且这些分化的NE细胞多以单个或者细胞巢的形式分散存在。我们以往的研究结果显示,大肠腺癌、胃腺癌、前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌中NE细胞的发现率分别为41.5%,39.6%,38.1%,21%和17.9%,并发现在大肠癌、前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌中,高分化腺癌NE细胞的发现率明显高于低分化腺癌,而胃癌则相反,低分化腺癌中NE细胞的发生现率明显高于高分化腺癌。这些差异性是否与肿瘤所在部位的胚胎起源、肿瘤病因学、组织发生学的不同及遗传学改变有关,仍处于探索研究阶段。因此,通过分子生物学的方法认识NE细胞的性质,有助于更深入的认识胃癌发生、发展的机理,并为临床诊断和治疗提供依据。目前国内外对非神经内分泌肿瘤中NE细胞的研究较少,特别是用分子遗传学方法研究普通型胃腺癌中单个NE细胞的起源方面尚未见报道。关于胃腺癌中NE分化的发生机制存在许多不同的假说,多数学者认为NE细胞和上皮细胞均来源于内胚层多潜能干细胞。在肿瘤发生及演进过程中,内胚层的多潜能干细胞受激素、局部微环境及基因组不稳定性的影响,使某些被抑制的基因组密码发生随机脱抑制,在RNA水平选择性激活两种以上调节机制,最终导致基因产生双向或多向分化。然而,这些推测仅建立在形态学观察的基础之上,缺乏可靠性。这些散在的NE细胞是否存在基因水平的改变,它们是肿瘤的实质成分,还是仅仅作为肿瘤的间质成分存在,尚无明确定论。激光捕获显微切割技术(Laser capturemicrodissection,LCM)可以使研究者可以获得形态完整的单一细胞或细胞群进行遗传学研究,解决了目的细胞的捕获难题。由于该技术在切除和提取细胞过程中不产生热量,对目的细胞没有任何损伤,即避免了邻近细胞的污染,又不会损伤DNA、RNA。目前国际上很多研究,其样本的获取都是利用了LCM技术。DNAMicro-kit试剂盒可以对微量组织或LCM捕获的细胞进行DNA抽提,联合应用Repli-g扩增试剂盒进行全基因组扩增,可以获得足量DNA用于后续的实验研究。野生型p53(wt-p53)作为抑癌基因,在正常组织中参与了细胞周期调控、细胞凋亡等过程,发生突变或缺失时,将丧失上述功能,使细胞增殖失控,凋亡受阻,从而引发肿瘤。错配修复功能的完整是细胞DNA准确复制和基因组稳定的基本保证。该功能缺失与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。MLH1基因是错配修复基因家族的重要成员之一,具有修复DNA碱基错配,增强DNA复制忠实性,维持基因组稳定性降低自发性突变的功能。E-cadherin(上皮型钙粘蛋白)是一种介导同种细胞相互黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白,对细胞极性的建立,维持上皮细胞正常形态至关重要。抑癌基因PTEN在正常组织中参与了DNA损伤修复、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞间相互作用及抑制血管生成等过程。当PTEN发生突变或缺失时,将丧失上述功能,不但减少对细胞凋亡的调控,还可以促进细胞进入增殖周期,导致细胞的无限增殖。干细胞在分化过程中,染色体有丝分裂不均衡,可造成部分基因在两种分化的细胞中同时出现等位基因的改变(如增益、丢失、突变等),通过对微卫星改变(包括微卫星不稳定和杂合性丢失)及突变、CGH等的检测可推测组织细胞的克隆性来源。我们在全基因组范围内选取多个微卫星位点,联合p53突变检测,对普通型胃腺癌NE细胞进行分子水平上的研究,以期明确NE细胞的克隆性起源。我们制备了组织芯片,联合应用免疫组化方法检测CGA、p53、MLH1、E-cadherin、PTEN等5个指标在胃癌中的表达情况,结合随访资料,综合分析上述指标的表达与伴有NE分化胃癌的临床病理参数及预后的关系,为胃癌的诊断及预后评估提供理论指导。材料和方法本实验收集浙江省人民医院2001-2003年间胃腺癌及正常胃粘膜新鲜标本120例。首先用冰冻切片-嗜铬粒蛋白A(Chromogranin A,CgA)免疫组化方法对上述标本进行初筛,确定含NE细胞较多的组织,经红外线激光捕获显微切割获取500个左右单个NE细胞,应用DNA Micro-kit抽提试剂盒及Repli-g全基因组扩增试剂盒进行DNA抽提和全基因组放大,全基因组范围内选取26个微卫星位点,结合PCR-SSCP-银染色检测NE细胞和腺癌细胞微卫星改变情况,联合PCR-测序检测基因p53突变发生情况,推测胃腺癌中NE细胞的克隆性起源。收集浙江大学医学院附属第一医院和绍兴市人民医院手术切除胃癌标本共220例,另取31例同期非肿瘤胃黏膜组织作为对照。制备组织芯片,联合应用免疫组化检测CGA、p53、MLH1、E-cadherin、PTEN等5个指标在胃癌中的表达情况,结合随访资料,综合分析上述指标的表达与伴有NE分化胃癌的临床病理参数及预后的关系。结果1、免疫组化-激光捕获显微切割:120例胃腺癌新鲜组织中,含有中-大量NE细胞的占25.0%(30/120),在20倍物镜下捕获腺癌中单个NE细胞500个左右。2、微卫星分析结果:30例样本中MSI总发生率为27.4%,LOH总发生率为17.9%,各样本MSI发生率高于LOH。从不同细胞微卫星改变发生率比较,NE细胞与腺癌细胞发生率无明显差异。各样本MSI及LOH发生率与胃癌的临床病理参数之间无明显相关性。从两种细胞LOH及MSI一致性来看,例2、3、5、6、11、12、18、24、27、30在NE细胞和腺癌细胞中发生了完全一致的微卫星改变,其余样本除例7和10外,其他18例微卫星改变的差异无统计学意义。3、p53突变结果:30例样本中NE细胞和腺癌细胞p53突变主要集中在外显子7和8,从p53突变的一致性上看,样本4、14、21、27的NE细胞和腺癌细胞均发生了外显子7、8的一致性突变,例7的两种细胞突变不一致,例17仅腺癌细胞发生了突变。腺癌细胞p53突变有6例(20.0%),NE细胞p53突变有5例(16.7%)。临床病理资料显示多为浸润性低分化腺癌,TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期。统计学分析显示p53突变与胃腺癌分化程度、TNM分期、血管浸润和淋巴结转移相关(P＜0.05)。4、结合微卫星改变及基因突变结果,30例伴NE分化的普通型胃腺癌中,27例NE细胞与腺癌细胞起源于同一干细胞,NE细胞作为肿瘤成分,本身具恶性且分泌激素促进肿瘤生长。其余3例微卫星改变及基因突变不一致,可能是激素或微环境作用的结果,有待于进一步研究。5、胃癌中CGA蛋白表达率为47.7%,其表达与胃癌分化程度相关,低、未分化组的阳性率较高。在p53阳性组中NE分化占46.5%,且NE分化与胃癌浸润深度呈正相关,与患者的生存时间呈负相关,CGA阳性表达患者的预后较差。6、p53蛋白在胃癌中的表达率为45.0%,明显高于正常对照组,其表达与胃癌TNM分期、浸润深度呈正相关。在NE分化胃癌中,p53蛋白表达与浸润深度和远处转移呈正相关。生存分析显示,阳性表达患者预后差。7、在胃癌中E-cadherin蛋白阳性率为为15.5%,低于正常胃粘膜表达率,其阳性表达与TNM分期及脉管侵犯呈负相关,阳性表达患者的生存率显著高于阴性者。8、MLH1蛋白在胃癌中的阳性表达率为15.9%,较正常对照组低。MLH1蛋白在NE细胞阳性组胃癌中的表达与TNM分期呈负相关,生存分析显示,阳性表达患者有较好的预后。9、PTEN蛋白在胃癌中的阳性率为27.3%,阳性表达与胃癌各临床病理参数及预后之间均无相关性。结论1、在分子水平证实胃腺癌中NE细胞与腺癌细胞起源存在一致性。2、NE分化与p53蛋白表达能促进胃癌的浸润和转移,提示预后不良。3、MLH1、E-cadherin有抑制胃癌进展的作用,可为预后评估提供理论指导。