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在中国,乳腺癌已经成为发病率最高的女性恶性肿瘤。根据国家癌症中心2015年的统计数据显示,乳腺癌不仅占据了女性新发肿瘤总数的15%,也是45岁以下女性因恶性肿瘤死亡的首要病因。更为严峻的是,当前我国乳腺癌的发病率和死亡率都呈上升趋势,严重危害着广大女性的健康和生命。实体肿瘤患者的发病和死亡一般由扩散的肿瘤细胞对机体正常功能的破坏导致,因此肿瘤细胞迁移已成为癌症转移潜在机制研究的一大热点。然而,介导乳腺癌细胞迁移的分子机制并不十分明确,可预测其进展转移的分子标志物仍然有限。发现乳腺癌进展转移过程中的关键分子及调节通路是乳腺癌研究中的重点,有助于指导乳腺癌早期诊疗从而降低病死率改善预后。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是近年来发现的一类不编码蛋白质的,长度超过200bp的RNA分子,许多文献报道lncRNA在肿瘤进展转移的过程中发挥重要作用。现有研究表明,lncRNA通过多种机制发挥抑癌或促癌功能,其中lncRNA与miRNA之间的相互作用机制主要有:miRNA结合并降解 lncRNA,lncRNA 作为 miRNA 海绵(miRNA sponge)结合吸附 miRNA,以及lncRNA截短生成miRNA等。长链非编码 RNA SNHG16 全称为 small nucleolar RNA host gene 16,即核内小 RNA 宿主基因 16,又叫 non-coding RNA expressed in aggressive neuroblastoma(ncRAN),是一种最早在神经母细胞瘤中发现的lncRNA,并且被证明在结直肠癌和膀胱癌中有促癌作用。然而,SNHG16是否影响乳腺癌的进展转移及其作用机制尚无报道。因此,本课题旨在研究SNHG16在乳腺癌进展转移中的作用及其涉及的分子生物学机制。研究内容主要分为以下四个部分:一.SNHG16在乳腺癌中的异常表达及其对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响;二.SNHG16在乳腺癌中发挥作用的关键下游miRNA和竞争性内源RNA的预测及验证;三.SNHG16的下游分子miR-98和E2F5在乳腺癌细胞迁移中的功能及二者之间的靶向作用验证;四.SNHG16对E2F5的调节作用及对乳腺癌细胞迁移功能的影响依赖于miR-98。第一部分SNHG16在乳腺癌中的异常表达及其对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响目的:以往研究表明SNHG16在神经母细胞瘤、膀胱癌以及结直肠癌中异常高表达,并发挥促癌的作用。但是SNHG16在乳腺癌中的功能尚不清楚。本研究首先确定乳腺癌组织标本中SNHG16的表达水平,再通过调控乳腺癌细胞系中SNHG16的表达来进行体外实验以确定其对乳腺癌细胞增殖迁移能力的影响。方法:收集乳腺癌肿瘤组织及癌旁非肿瘤组织共30对,提取总RNA并反转录,通过相对实时定量PCR(qRT-PCR)检测乳腺癌肿瘤组织及癌旁非肿瘤组织中SNHG16的表达差异。同时检测常用乳腺癌细胞系中SNHG16的表达水平,选取表达量较高的细胞系进行干扰实验,表达量较低的细胞系进行过表达实验。采用MTT实验测定SNHG16对乳腺癌细胞增殖能力的影响。通过Transwell细胞迁移实验中穿过小室滤膜的细胞数目来检测调控SNHG16表达后细胞迁移能力的改变。结果:QRT-PCR结果表明,30对乳腺组织中有21对中的SNHG16在乳腺癌组织比正常组织表达升高。SNHG16在MDA-MB-231和MCF-7细胞系中表达量较高,在MDA-MB-468和SK-BR-3细胞系中表达较低。MTT实验证明SNHG16对乳腺癌细胞增殖无明显作用。Transwell实验结果表明在MDA-MB-231和MCF-7细胞系中干扰SNHG16后,细胞迁移能力下降;在MDA-MB-468和SK-BR-3细胞系中过表达SNHG16后,细胞迁移能力增强。结论:SNHG16在乳腺癌中具有促癌作用,能够增强乳腺癌细胞的迁移能力,对乳腺癌细胞增殖无明显作用。第二部分SNHG16在乳腺癌中发挥作用的关键下游miRNA和竞争性内源RNA的预测及验证目的:近年来的研究表明,长链非编码RNA可能参与竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)调控网络从而发挥功能。为了进一步探究SNHG16在乳腺癌中发挥作用的分子生物学机制,本研究首先应用生物信息学方法预测SNHG16可能相互调控的ceRNA及共同作用的miRNA,并通过一系列分子生物学实验验证SNHG16与下游miRNA的直接结合,最后在乳腺癌组织中进一步验证SNHG16与下游miRNA的相关性。方法:通过数据库预测SNHG16可能相互调控的ceRNA及其共同作用的miRNA,干扰或过表达SNHG16后,采用qRT-PCR实验检测候选ceRNA及miRNA的表达量改变,从而进一步鉴定SNHG16的关键下游分子。通过DIANA TOOLS预测二者与其共同作用的miRNA相互结合的位点,构建相应的工具载体及其结合位点突变载体,进行RNA免疫共沉淀(RIP)实验和荧光素酶报告基因实验(luciferase reporter assay)验证SNHG16与下游miRNA的直接结合和具体结合位点。同时qRT-PCR检测过表达候选miRNA后SNHG16的表达水平,进一步验证二者之间的相互作用。最后在乳腺癌组织中检测SNHG16与候选下游miRNA的表达水平并进行相关性分析。结果:从starBase数据库预测SNHG16可能相互调控的ceRNA包括Rap2B,HMGA2,AMOT,SMAD2,E2F5,ZEB1等。按照竞争性内源RNA调控理论,干扰SNHG16后,候选ceRNA的表达会由于二者之间共同的miRNA增多而减少;而过表达SNHG16后,候选ceRNA的表达会由于二者之间共同的miRNA减少而增多。因此,分别过表达和干扰SNHG16后进行qRT-PCR实验验证SNHG16与候选ceRNA的调控关系,结果表明干扰或过表达SNHG16后,E2F5表达量出现了相应下降或增多,而其他候选ceRNA的表达量未出现明显一致的变化,进一步提示E2F5很有可能为SNHG16的ceRNA。随后通过DIANA TOOLS预测二者与其共同作用的miRNA及相互结合的位点,并通过qRT-PCR实验验证SNHG16可能对miR-98具有海绵吸附作用(miRNA sponge)。构建野生型和突变型载体,进行RNA免疫共沉淀实验和荧光素酶报告基因实验进一步验证SNHG16与下游miR-98的直接结合和具体结合位点。过表达miR-98后SNHG16表达降低,进一步证明SNHG16与miR-98之间的相互作用。QRT-PCR结果统计分析表明,在乳腺癌组织中SNHG16与miR-98的表达水平呈显著负相关。结论:SNHG16与miR-98存在直接相互结合作用,可能作为ceRNA与E2F5竞争性结合miR-98从而发挥促癌功能。第三部分SNHG16的下游分子miR-98和E2F5在乳腺癌细胞迁移中的功能及二者之间的靶向作用验证目的:为了探究SNHG16是否通过miR-98和E2F5这一调控轴线在乳腺癌中发挥作用,对于下游分子miR-98和E2F5在乳腺癌中的功能及二者之间的靶向作用需要进一步验证。方法:首先在乳腺癌细胞中过表达miR-98后进行Transwell细胞迁移实验,并进行统计分析验证miR-98对乳腺癌细胞迁移的影响。通过荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR及Western Blot(蛋白免疫印记)实验验证miR-98与E2F5的直接靶向作用。通过干扰E2F5后的Transwell实验验证E2F5在乳腺癌细胞迁移中的作用。最后检测乳腺癌肿瘤组织及癌旁非肿瘤组织中E2F5的表达差异并进行统计分析证明E2F5在乳腺癌中的功能。结果:Transwell细胞迁移实验证明过表达miR-98或干扰E2F5后能够显著抑制乳腺癌细胞迁移。荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR及Western Blot实验证明miR-98能够直接靶向E2F5并调控其表达。30对乳腺组织中有23对中的E2F5在乳腺癌组织比正常乳腺组织表达升高。结论:miR-98能够显著抑制乳腺癌细胞迁移,E2F5作为miR-98的直接靶基因,干扰其表达后也能发挥类似功能。第四部分SNHG16对E2F5的调节作用及对乳腺癌细胞迁移功能的影响依赖于miR-98目的:为了证明SNHG16是通过与E2F5竞争性结合miR-98发挥促进乳腺癌细胞迁移的功能,我们进一步探究SNHG16对E2F5的调节作用并验证这种调节作用和SNHG16对乳腺癌细胞迁移功能的影响是否依赖于miR-98。方法:在MDA-MB-231和MCF-7细胞系中干扰SNHG16或在MDA-MB-468和SK-BR-3细胞系中过表达SNHG16后,通过qRT-PCR及Western Blot实验检测E2F5的表达变化。在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中检测SNHG16和E2F5的表达水平并进行相关性分析。进行"挽救"(rescue)实验即共转染SNHG16和miR-98观察miR-98是否可以逆转SNHG16对乳腺癌细胞迁移能力的增强作用以及对E2F5的调控作用。结果:QRT-PCR及Western Blot实验结果表明干扰SNHG16后,E2F5表达量降低;过表达SNHG16后,E2F5表达量升高。在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中SNHG16和E2F5的表达水平呈显著正相关,也从侧面验证了 SNHG16对E2F5的正调控作用。Rescue实验结果表明,与SNHG16共转染入miR-98后,miR-98能够部分消除SNHG16介导的细胞迁移增强以及SNHG16对E2F5的正调控作用。结论:SNHG16对E2F5的表达具有正调控作用,并且SNHG16对E2F5的调节作用及对乳腺癌细胞迁移功能的影响依赖于miR-98。本论文重点阐述了 SNHG16在乳腺癌进展转移中的功能及其具体作用的分子机制。创新之处主要表现为以下几点:1.首次对SNHG16在乳腺癌细胞迁移中的作用进行探究并证明SNHG16发挥作用依赖于miR-98;2.首次提出SNHG16作为竞争性内源RNA与E2F5竞争性结合miR-98从而发挥作用;3.通过RNA免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验验证了 SNHG16与miR-98的直接结合,并设计突变载体证实了数据库预测的结合位点;4.揭示了 SNHG16在乳腺癌中对E2F5的正向调控作用。本论文尚存在一些不足,也是我们未来的研究方向,主要存在以下几点:1.论文主要对SNHG16在乳腺癌细胞增殖和迁移方面的功能进行了探究,尚未在乳腺癌细胞侵袭、凋亡、化疗耐药等方面发现明显调控功能,需要进一步研究。2.课题主要利用乳腺癌细胞系进行了体外实验研究SNHG16对乳腺癌转移的影响,尚需包括裸鼠成瘤及肺转移模型等体内实验进一步完善SNHG16在乳腺癌中作用功能的探究。3.本研究在临床标本中仅对SNHG16和下游分子在乳腺癌组织及癌旁非肿瘤组织中进行了表达差异及相关性分析,尚未与目前现有的乳腺癌分型指标进行对比研究,需要进一步扩大标本量进行明确的病理分型分析。