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为了探讨从ES细胞获取HSPC进行临床HSPCT的可行性,解决由此可能产生的问题如移植物抗宿主反应(graft versus host reaction,GVHR)和细胞免疫功能缺陷等,我们分三阶段进行了如下的实验研究:第一章 ESE14.1细胞基本特性及功能检测 目的:了解小鼠胚胎干细胞株ESE14.1细胞的体外培养特性,同时检测ESE14.1细胞的未分化状态及多向分化潜能.方法:通过比较在含白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)的培养液中培养和在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)滋养层上培养,探讨ESE14.1细胞的合适培养条件;检测碱性磷酸酶的活性以了解ESE14.1细胞的未分化状态;用小鼠体内成瘤试验证实ESE14.1细胞的多向分化潜能.第二章 ESE14.1体外诱导分化为CD<,34><+>的HSPC 目的:体外诱导ESE14.1细胞分化,加入HGFs是为了增加HSPC的产量;同时添加HGFs和胸腺肽,是为了在不影响HSPC产量的情况下,增加CD<,3><+>的T细胞含量;同时添加HGFs、胸腺肽和受体鼠脾细胞,是为了在不影响HSPC和CD<,3><+>的T细胞产量的情况下,诱导对受体鼠特异的免疫耐受.方法:去除LIF,使ESE14.1细胞在含甲基纤维素的培养液中分化形成胚胎体(embryoid body,EB);第6日第1组添加IMDM分化培养液,第2组添加HGFs;第3组添加HGFs和胸腺肽,第4组添加HGFs、胸腺肽和线裂霉素处理过的受体鼠脾细胞悬液,继续分化培养.间接免疫荧光和流式细胞仪检测分化细胞表面的CD<,34>和CD<,3>抗原.第三章 ESE14.1细胞来源CD<,34><+>的HSPC体内实验 目的:探讨上一章第2组、第3组和第4组所产生含CD<,34><+>HSPC的分化细胞重建致死量照射小鼠造血功能、免疫功能方面的差异,并验证第4组免疫耐受的形成.方法:将上章第2组、第3组和第4组含CD<,34><+>HSPC的分化细胞,分别注射入致死照射小鼠体内,比较各组小鼠的存活情况,GVHD的临床表现,体重的改变,病理学改变,并用PCR的方法检测,受体鼠没有而ESE14.1细胞及其产生的分化细胞具有的,Y染色体特异的性别决定基因(Sex determining region of the Y-chromsome,Sry)以判断移植细胞在宿主体内的存活情况.