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超低温保存技术在遗传育种、贝类养殖以及种质资源保存等方面具有重要的意义。本文以CASA（计算机辅助精子分析系统）为评价指标摸索了皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）精子超低温冷冻保存条件，初步建立了皱纹盘鲍精子冷冻保存方法。然后分别采用扫描电镜和透射电镜对冷冻前后精子的形态结构与超微结构进行研究，探明了冷冻保存对精子的损伤情况。最后，利用SCGE（单细胞凝胶电泳）对不同浓度的DMSO作为精子的抗冻剂，经超低温冷冻保存以后对精子DNA损伤情况进行了研究。 1.皱纹盘鲍精子超低温冷冻保存方法的建立 本实验首先对四种稀释液（FSW、Ringer、 Hanks、RMPI-1640）进行了筛选，结果表明FSW(pH8.1，盐度33)为最适宜精子保存稀释液;然后对四种抗冻剂(DMSO、GLY、MET、PEG)五个浓度梯度(2％、6％、10％、14％、18％)分别做了毒性试验和冷冻保存效果筛选，实验结果显示抗冻剂对精子毒性从大到小依次是MET＞GLY＞PEG＞DMSO，并且抗冻剂筛选结果显示10％ DMSO为最佳抗冻剂，冻后精子可获得72.88±4.96％运动率，其次具有较好保存效果的抗冻剂是14％ DMSO和6％ DMSO，并用CASA分析精子的运动参数VSL、VCL、VAP、LIN及WOB对实验结果进一步进行了验证。通过低温温度计进行对6个冷冻过渡温度（0℃、-20℃、-40℃、-60℃、-80℃、-100℃）的实验，以精子运动率和VCL两个评价指标得出-80℃和-60℃适合作为皱纹盘鲍精子的冷冻过渡温度;解冻温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)六个梯度的筛选结果表明40℃为最适解冻温度，且随着解冻温度的升高，所用解冻时间明显缩短。并对2 mL冻存管保存体积四个梯度(0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL)筛选结果发现，1.5mL和1mL为最适保存体积，体积过大或过小都不利于皱纹盘鲍精子的保存。最后，通过受精率标准化实验筛选，以精卵比1000∶1对冻精做了人工授精实验，结果显示10％ DMSO作为抗冻剂，皱纹盘鲍冻存精子的受精率和孵化率最高，分别为66±3.5％和55.83±3.54％，实验结果显著高于其他实验组，但实验组与对照组相比，均有显著性差异(p＜0.05)。 2.皱纹盘鲍精子冷冻前后形态和超微结构的损伤情况 通过扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)对皱纹盘鲍精子冷冻前后进行观察分析，结果发现冻后精子约有35.96％(n=180)左右的精子有了不同程度的损伤，扫描电镜结果主要表现为精子顶体出现空洞、异常肿胀、顶体内容物释放、冷冻精子的顶体与细胞核的连接部位裂开、鞭毛从精子中段或鞭毛中间断裂等形态结构损伤;而透射电镜结果表明冻精的质膜出现膨胀、线粒体肿胀及双层膜破损内容物溢出等;透射电镜下，鞭毛横切结果显示皱纹盘鲍精子为“9+2”结构，以及细胞核部位出现损伤，质膜及鞭毛膨胀，染色质缺失等现象。 3.皱纹盘鲍精子冷冻后DNA损伤情况研究 通过SCGE实验，以鲜精为对照，采用CASP软件分析了冻精DNA的损伤情况，计算了不同浓度DMSO保存精子的彗星率，实验结果显示10％ DMSO、6％ DMSO彗星率最低，分别为47.43±6.18％和67.95±7.3％，与CASA分析精子冻后运动率的结果相一致，另外就彗星强度参数、长度参数、矩类参数对皱纹盘鲍精子分析适用性做了探究，结果发现Tail Moment、Olive Tail Moment、TailLength、Head DNA％、Tail DNA％等参数能够作为SCGE分析皱纹盘鲍精子中DNA损伤的分析指标。