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近些年来，禽流感(Avian influenza，AI)不仅对我国养禽业造成巨大损失，而且还影响到了野生鸟类的种群结构并严重威胁世界公共卫生安全。野生鸟类的迁徙是一种自然现象，可以造成流感病毒的传播。很多学者认为野生鸟类是禽流感病毒的天然宿主，尤其是雁形目等野生鸟类与禽流感病毒的传播密切相关。已有文献报道从27目、241种野鸟宿主体内分离到包括H5和H7在内的多种亚型流感。自2013年春季，在中国多地区出现人感染H7N9亚型禽流感病毒，截止到2019年3月末，1567例确诊的患者中615人死亡，致死率高达39.25％，再次提醒人们要关注H7亚型禽流感病毒对公共卫生安全的潜在威胁。
本实验室前期分别从青头潜鸭和小白额雁体内分离到两株野鸟源流感病毒:A/Baers Pochard/HuNan/414/2010（H7N1）（以下简称WT-H7N1）和1株A/Lesser White-fronted Goose/HuNan/412/2010(H7N7)（以下简写为WT-H7N7），初步研究表明WT-H7N1和WT-H7N7对小鼠致病力较弱，为进一步研究它们在哺乳动物中的适应能力，我们以小鼠为哺乳动物模型，将两株病毒在小鼠体内连续传代，制备小鼠适应株并评价致病力，为评估野鸟源H7亚型流感病毒对公共卫生安全的的影响提供理论参考。
1、2株H7亚型野鸟源禽流感病毒小鼠适应株的制备
分别将WT-H7N1和WT-H7N7毒株在小鼠体内传代，分别在第5代和第7代小鼠于攻毒后第2d死亡，收取鼠肺病毒液，分别命名为MA-PIP5、MA-P3P5和MA-HIP7和MA-H2P7。MA-P1P5和MA-P3P5的MLD50(lg EID50)分别为2.25和1.75，比WT-H7N1分别提高了10000倍和31623倍;MA-H1P7和MA-H2P7的MLD50(lg EID50)分别为3.5和2.75，比WT-H7N7分别提高了1000倍和5000倍。
全基因测序结果表明，MA-PIP5发生了5个氨基酸突变分别为PB2-E627K、HA-E122K、HA-G214E、HA-G227E和NA-S350N，MA-P3P5发生了6个氨基酸突变分别为PB2-1615T、PB2-E627K、HA-E122K、HA-G214E、HA-G227E和NA-S350N;MA-HIP7发生了4个氨基酸突变分别为PB2-E627K、PBI-R1181、PA-L550M和HA-G214R，MA-H2P7发生了5个氨基酸突变分别为PB2-E627K、PBl-R118I、PA-L550M、HA-G214R和NA-S372N。
2、2株H7亚型野鸟源禽流感病毒小鼠适应株体外和体内复制能力及组织嗜性测定
为研究小鼠适应株的体外复制能力;根据病毒的TCID50将病毒稀释至0.01个MOI接种于MDCK细胞，处理后每隔12h检测病毒滴度直至72h，小鼠适应株与原毒株相比在48h病毒滴度(Log10TCID50/ml)显著提高，MA-PIP5、MA-P3P5、MA-H1P7和MA-H2P7分别为5.75、6.05、6.02和6.08。
为了进一步研究小鼠适应株的体内复制能力;以104EID50攻毒剂量攻毒小鼠，分别在攻毒后第3d和5d，取小鼠肺脏检测病毒滴度，MA-P1P5第3d和5d的病毒滴度分别是108.5±0.1EID50/g和108.6±0.2EID50/g，比WT-H7N1分别升高了40倍和8倍:MA-P3P5第3d和5d的病毒滴度分别是107.4±0.2EID50/g和107.9±0.1EID50/g，比WT-H7N1分别升高了3倍和1.6倍;MA-H1P7第3d和Sd的病毒滴度分别是107.9±0.9EID50/g和108.4±0.5EID50/g，比WT-H7N7分别升高了398倍和126倍;MA-H2P7第3d和5d的病毒滴度分别是108.2±0.7EID50/g和107.1±0.1EID50/g，比WT-H7N7分别升高了7943倍和6倍。
为了研究小鼠适应株的组织嗜性;以106EID50攻毒剂量攻毒小鼠，攻毒后第3d，按顺序取小鼠肺脏、脑、肝脏、脾脏、肾脏和肠，并检测其病毒滴度显示WT-H7N1能在小鼠的肺脏和肠中检测出病毒，而WT-H7N7只能在肺脏检测出病毒。值得注意的是，2株野鸟源的H7型流感病毒的小鼠适应株在肺脏、脑、肝脏、脾脏、肾脏和肠中均能检测出病毒，表明病毒在适应过程中组织嗜性增强。
3、H7N1和H7N7亚型禽流感病毒在小鼠体内适应过程中氨基酸突变与致病力分析
为了研究WT-H7N1和WT-H7N7在小鼠体内适应过程中基因突变过程与致病力的关联性;对不同代次的小鼠适应株进行了全基因组测序和小鼠攻毒实验;WT-H7N1病毒株在适应过程中PB2-E627K出现在第5代，其MLD50(lg EID50)为1.75，106EID50接毒小鼠3d后肺脏病理组织切片可以看出肺间质血管充血、血管壁水肿、增厚:WT-H7N7病毒株在适应过程中PB2-E627K出现在第3代，其MLD50(lg EID50)为4.5，106EID50接毒小鼠3天后肺脏病理组织切片可以看出肺脏小血管和细支气管周围炎症性细胞浸润。
综上我们得出WT-H7N1和WT-H7N7可以在小鼠体内适应，并成功制备小鼠适应株，野病毒株在适应过程中对小鼠致病能力和组织嗜性显著增强、体外体内复制能力增加，并发现PB2-E627K（哺乳动物适应性分子标记）同时出现在4株小鼠适应株中，推测其是使小鼠适应株毒力增强的关键因素。以上研究结果表明，野鸟源H7亚型流感病毒对哺乳动物（小鼠）具有很强的适应能力，对公共卫生安全的存在潜在威胁性，需要给予更多的关注。
本实验室前期分别从青头潜鸭和小白额雁体内分离到两株野鸟源流感病毒:A/Baers Pochard/HuNan/414/2010（H7N1）（以下简称WT-H7N1）和1株A/Lesser White-fronted Goose/HuNan/412/2010(H7N7)（以下简写为WT-H7N7），初步研究表明WT-H7N1和WT-H7N7对小鼠致病力较弱，为进一步研究它们在哺乳动物中的适应能力，我们以小鼠为哺乳动物模型，将两株病毒在小鼠体内连续传代，制备小鼠适应株并评价致病力，为评估野鸟源H7亚型流感病毒对公共卫生安全的的影响提供理论参考。
1、2株H7亚型野鸟源禽流感病毒小鼠适应株的制备
分别将WT-H7N1和WT-H7N7毒株在小鼠体内传代，分别在第5代和第7代小鼠于攻毒后第2d死亡，收取鼠肺病毒液，分别命名为MA-PIP5、MA-P3P5和MA-HIP7和MA-H2P7。MA-P1P5和MA-P3P5的MLD50(lg EID50)分别为2.25和1.75，比WT-H7N1分别提高了10000倍和31623倍;MA-H1P7和MA-H2P7的MLD50(lg EID50)分别为3.5和2.75，比WT-H7N7分别提高了1000倍和5000倍。
全基因测序结果表明，MA-PIP5发生了5个氨基酸突变分别为PB2-E627K、HA-E122K、HA-G214E、HA-G227E和NA-S350N，MA-P3P5发生了6个氨基酸突变分别为PB2-1615T、PB2-E627K、HA-E122K、HA-G214E、HA-G227E和NA-S350N;MA-HIP7发生了4个氨基酸突变分别为PB2-E627K、PBI-R1181、PA-L550M和HA-G214R，MA-H2P7发生了5个氨基酸突变分别为PB2-E627K、PBl-R118I、PA-L550M、HA-G214R和NA-S372N。
2、2株H7亚型野鸟源禽流感病毒小鼠适应株体外和体内复制能力及组织嗜性测定
为研究小鼠适应株的体外复制能力;根据病毒的TCID50将病毒稀释至0.01个MOI接种于MDCK细胞，处理后每隔12h检测病毒滴度直至72h，小鼠适应株与原毒株相比在48h病毒滴度(Log10TCID50/ml)显著提高，MA-PIP5、MA-P3P5、MA-H1P7和MA-H2P7分别为5.75、6.05、6.02和6.08。
为了进一步研究小鼠适应株的体内复制能力;以104EID50攻毒剂量攻毒小鼠，分别在攻毒后第3d和5d，取小鼠肺脏检测病毒滴度，MA-P1P5第3d和5d的病毒滴度分别是108.5±0.1EID50/g和108.6±0.2EID50/g，比WT-H7N1分别升高了40倍和8倍:MA-P3P5第3d和5d的病毒滴度分别是107.4±0.2EID50/g和107.9±0.1EID50/g，比WT-H7N1分别升高了3倍和1.6倍;MA-H1P7第3d和Sd的病毒滴度分别是107.9±0.9EID50/g和108.4±0.5EID50/g，比WT-H7N7分别升高了398倍和126倍;MA-H2P7第3d和5d的病毒滴度分别是108.2±0.7EID50/g和107.1±0.1EID50/g，比WT-H7N7分别升高了7943倍和6倍。
为了研究小鼠适应株的组织嗜性;以106EID50攻毒剂量攻毒小鼠，攻毒后第3d，按顺序取小鼠肺脏、脑、肝脏、脾脏、肾脏和肠，并检测其病毒滴度显示WT-H7N1能在小鼠的肺脏和肠中检测出病毒，而WT-H7N7只能在肺脏检测出病毒。值得注意的是，2株野鸟源的H7型流感病毒的小鼠适应株在肺脏、脑、肝脏、脾脏、肾脏和肠中均能检测出病毒，表明病毒在适应过程中组织嗜性增强。
3、H7N1和H7N7亚型禽流感病毒在小鼠体内适应过程中氨基酸突变与致病力分析
为了研究WT-H7N1和WT-H7N7在小鼠体内适应过程中基因突变过程与致病力的关联性;对不同代次的小鼠适应株进行了全基因组测序和小鼠攻毒实验;WT-H7N1病毒株在适应过程中PB2-E627K出现在第5代，其MLD50(lg EID50)为1.75，106EID50接毒小鼠3d后肺脏病理组织切片可以看出肺间质血管充血、血管壁水肿、增厚:WT-H7N7病毒株在适应过程中PB2-E627K出现在第3代，其MLD50(lg EID50)为4.5，106EID50接毒小鼠3天后肺脏病理组织切片可以看出肺脏小血管和细支气管周围炎症性细胞浸润。
综上我们得出WT-H7N1和WT-H7N7可以在小鼠体内适应，并成功制备小鼠适应株，野病毒株在适应过程中对小鼠致病能力和组织嗜性显著增强、体外体内复制能力增加，并发现PB2-E627K（哺乳动物适应性分子标记）同时出现在4株小鼠适应株中，推测其是使小鼠适应株毒力增强的关键因素。以上研究结果表明，野鸟源H7亚型流感病毒对哺乳动物（小鼠）具有很强的适应能力，对公共卫生安全的存在潜在威胁性，需要给予更多的关注。