论文部分内容阅读
松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）的低温抗逆与其长期存活的滞育型虫态-扩散型3龄幼虫(LⅢ)密切相关。LⅢ可以在低温等不利条件下生存，在松材线虫越冬和向东北等低温地区扩散过程中起重要作用。海藻糖与生物抵抗环境压力密切相关。为了探究LⅢ形成和低温抗逆的分子机理以及海藻糖在此过程中的功能，完成了21个RNA-Seq测序，并鉴定到松材线虫海藻糖代谢基因9条，对这9条基因与LⅢ形成和低温抗逆相关功能进行了研究。具体研究内容及主要结果如下:
1.权重基因共表达网络分析(WGCNA)鉴定LⅢ高相关基因集:应用WGCNA对松材线虫7个不同发育阶段共21个RNA-Seq测序结果中所包含的15，889个基因的表达模式进行综合分析，共获得12个共表达模块。其中magenta模块与LⅢ相关性最高，模块内共包括652个基因。GO富集分析表明magenta模块内基因多数存在于细胞或细胞内，具有催化活性或结合功能，参与生物过程、代谢过程或细胞过程。KEGG富集分析表明magenta模块内的基因大多参与代谢过程，与自噬过程及长寿调节相关。其中代谢大类下有较多基因富集到碳水化合代谢和脂质代谢两个小类，糖类含量测定发现LⅢ中海藻糖含量高于繁殖型各发育阶段。为探究海藻糖对松材线虫在不良环境保护作用的分子机理，特别是海藻糖在LⅢ的形成及抗低温过程中的具体功能，选取海藻糖代谢基因为进一步研究对象。
2.松材线虫9条海藻糖代谢基因克隆及在各个发育阶段表达模式分析:为了探索海藻糖在LⅢ的形成和低温下存活中的功能，在松材线虫中分别鉴定到1个海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)编码基因（Bx-tps）、1个海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)编码基因（Bx-tpp）和7个海藻糖酶(TRE)编码基因（Bx-tres）。对这9个海藻糖代谢基因的表达模式进行探究，RT-PCR结果表明Bx-tps和Bx-tpp在LⅢ内的表达量显著高于在其它发育阶段，该结果与DGE测序结果趋势相同。因此，TPS与TPP可能在LⅢ中起到更为重要的作用。
3.松材线虫9条海藻糖代谢基因在LⅢ形成中的功能:RNAi降低Bx-tps或Bx-tpp的表达水平后，TPS活性下降，海藻糖含量和LⅢ形成率均降低。通过RNAi降低Bx-tres的表达水平后，TRE活性下降，海藻糖含量增加，LⅢ的形成率降低。以上结果表明海藻糖代谢基因表达与LⅢ的形成相关。Bx-tps沉默处理后，LⅢ的形成率最低，表明Bx-tps基因表达与LⅢ的形成更为密切。
4.松材线虫9条海藻糖代谢基因在LⅢ抗低温中的功能:-20℃低温处理后，Bx-tps与Bx-tpp表达量显著上升，Bx-trel，Bx-tre2，Bx-tre3，Bx-tre4，Bx-tre5，Bx-tre6与Bx-tre7表达量显著下降，海藻糖含量上升，TPS活性上升，TRE活性下降，表明低温胁迫诱导LⅢ积累海藻糖。海藻糖代谢基因分别沉默后，与对照组相比，各RNAi处理组LⅢ在25℃下的存活率无明显变化，但在-20℃下的存活率均显著下降，表明海藻糖代谢基因表达与LⅢ抗低温相关。Bx-tps或Bx-tpp沉默处理后，LⅢ在低温下的存活率下降较多，表明Bx-tps或Bx-tpp基因表达与LⅢ在低温下存活更为密切。
5.LⅢ形成及低温抗逆过程中，海藻糖代谢基因整合通路分析:WGCNA结果表明Bx-tps和Bx-tpp与LⅢ存在较强的相关性。因此，与海藻糖的水解相比，海藻糖的合成可能在LⅢ的形成和维持中发挥更重要的作用。进一步分析发现，magenta模块中与Bx-tps、Bx-tpp和LⅢ高度相关的基因多数参与代谢过程，包括糖代谢、碳代谢和脂肪酸代谢。其中18个基因富集到15个与能量转换及自噬相关的通路中，这些通路与多种长寿相关的信号通路相关，包括AMPK信号通路、类胰岛素因子信号通路、类胰高血糖素因子信号通路、溶酶体以及过氧化物酶体。这些基因在LⅢ中表达量显著高于其它发育阶段。
以上结果表明，海藻糖代谢促进LⅢ形成，并有助于LⅢ在低温下存活。虽然海藻糖积累有利于LⅢ应对低温胁迫，但需要多个海藻糖代谢基因协同工作完成一个海藻糖合成和降解的动态过程来帮助LⅢ在低温下存活。以上结果提示，在低温抗逆条件下存在一个Bx-tps和Bx-tpp参与的多通路调控的生理过程，这个生理过程可能通过自噬和能量转换来调控LⅢ的形成与维持。
1.权重基因共表达网络分析(WGCNA)鉴定LⅢ高相关基因集:应用WGCNA对松材线虫7个不同发育阶段共21个RNA-Seq测序结果中所包含的15，889个基因的表达模式进行综合分析，共获得12个共表达模块。其中magenta模块与LⅢ相关性最高，模块内共包括652个基因。GO富集分析表明magenta模块内基因多数存在于细胞或细胞内，具有催化活性或结合功能，参与生物过程、代谢过程或细胞过程。KEGG富集分析表明magenta模块内的基因大多参与代谢过程，与自噬过程及长寿调节相关。其中代谢大类下有较多基因富集到碳水化合代谢和脂质代谢两个小类，糖类含量测定发现LⅢ中海藻糖含量高于繁殖型各发育阶段。为探究海藻糖对松材线虫在不良环境保护作用的分子机理，特别是海藻糖在LⅢ的形成及抗低温过程中的具体功能，选取海藻糖代谢基因为进一步研究对象。
2.松材线虫9条海藻糖代谢基因克隆及在各个发育阶段表达模式分析:为了探索海藻糖在LⅢ的形成和低温下存活中的功能，在松材线虫中分别鉴定到1个海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)编码基因（Bx-tps）、1个海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)编码基因（Bx-tpp）和7个海藻糖酶(TRE)编码基因（Bx-tres）。对这9个海藻糖代谢基因的表达模式进行探究，RT-PCR结果表明Bx-tps和Bx-tpp在LⅢ内的表达量显著高于在其它发育阶段，该结果与DGE测序结果趋势相同。因此，TPS与TPP可能在LⅢ中起到更为重要的作用。
3.松材线虫9条海藻糖代谢基因在LⅢ形成中的功能:RNAi降低Bx-tps或Bx-tpp的表达水平后，TPS活性下降，海藻糖含量和LⅢ形成率均降低。通过RNAi降低Bx-tres的表达水平后，TRE活性下降，海藻糖含量增加，LⅢ的形成率降低。以上结果表明海藻糖代谢基因表达与LⅢ的形成相关。Bx-tps沉默处理后，LⅢ的形成率最低，表明Bx-tps基因表达与LⅢ的形成更为密切。
4.松材线虫9条海藻糖代谢基因在LⅢ抗低温中的功能:-20℃低温处理后，Bx-tps与Bx-tpp表达量显著上升，Bx-trel，Bx-tre2，Bx-tre3，Bx-tre4，Bx-tre5，Bx-tre6与Bx-tre7表达量显著下降，海藻糖含量上升，TPS活性上升，TRE活性下降，表明低温胁迫诱导LⅢ积累海藻糖。海藻糖代谢基因分别沉默后，与对照组相比，各RNAi处理组LⅢ在25℃下的存活率无明显变化，但在-20℃下的存活率均显著下降，表明海藻糖代谢基因表达与LⅢ抗低温相关。Bx-tps或Bx-tpp沉默处理后，LⅢ在低温下的存活率下降较多，表明Bx-tps或Bx-tpp基因表达与LⅢ在低温下存活更为密切。
5.LⅢ形成及低温抗逆过程中，海藻糖代谢基因整合通路分析:WGCNA结果表明Bx-tps和Bx-tpp与LⅢ存在较强的相关性。因此，与海藻糖的水解相比，海藻糖的合成可能在LⅢ的形成和维持中发挥更重要的作用。进一步分析发现，magenta模块中与Bx-tps、Bx-tpp和LⅢ高度相关的基因多数参与代谢过程，包括糖代谢、碳代谢和脂肪酸代谢。其中18个基因富集到15个与能量转换及自噬相关的通路中，这些通路与多种长寿相关的信号通路相关，包括AMPK信号通路、类胰岛素因子信号通路、类胰高血糖素因子信号通路、溶酶体以及过氧化物酶体。这些基因在LⅢ中表达量显著高于其它发育阶段。
以上结果表明，海藻糖代谢促进LⅢ形成，并有助于LⅢ在低温下存活。虽然海藻糖积累有利于LⅢ应对低温胁迫，但需要多个海藻糖代谢基因协同工作完成一个海藻糖合成和降解的动态过程来帮助LⅢ在低温下存活。以上结果提示，在低温抗逆条件下存在一个Bx-tps和Bx-tpp参与的多通路调控的生理过程，这个生理过程可能通过自噬和能量转换来调控LⅢ的形成与维持。