草地早熟禾(Poa pratensis)微卫星分子标记和染色体标记的开发及应用

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草地早熟禾(Poa pratensis)属禾本科早熟禾属(Poa)多年生草本植物,具有再生能力强、耐寒、耐旱、营养丰富、绿色周期长等特点,草地早熟禾作为优良草坪草和牧草在世界范围内得到广泛应用。本研究主要进行了草地早熟禾SSR分子标记和染色体标记的开发、应用研究,主要研究结果如下:  利用磁珠富集法分离、鉴定获得15对多态性SSR引物,15对具有多态性的SSR引物在14个草地早熟禾材料中SSR等位基因的数目变化为3~6,平均个数是3.8;多态性信息含量(PIC值)变化范围为0.39~0.5,其中有10对引物的PIC的最大值接近0.5。进一步对获得SSR引物进行物种转移性测试,结果表明15对引物中13对在扁茎早熟禾(P.pratensis Var.anceps Gaud)中能进行有效扩增,7对应物在冷地早熟禾(P.crymorphila Keng ex C.Ling)中具有有效扩增。15对具有多态性的引物中筛选出了多态性较好、条带清晰3对(Poap5、Poap9、Poap10)引物,对18个早熟禾品种进行指纹图谱的构建,3对引物在18个品种中共检测出16个多态性片段,每对引物可以检测到4~6个数目不等的片段,平均为5.33个,片段大小介于152bp~227bp之间。利用单一引物可将18个品种区分为5~11种类型,平均为8.33个类型。利用这3对SSR多态性引物指纹图谱可以将18个品种完全区分开。进一步利用引物Poap5、Poap9、Poap10对牧草品种青海草地早熟禾和青海扁茎早熟禾30个个体进行纯度鉴定,结果表明青海草地早熟禾的纯度在70%以上,青海扁茎早熟禾的纯度在76%以上。  通过对建立的草地早熟禾Cot~1文库利用荧光原位杂交(FISH)技术进行筛选,44个克隆中有17克隆在草地早熟禾染色体上具有杂交信号,进一步对筛选出的阳性克隆进行序列分析,最终确定17个克隆中具有4种独特序列。染色体原位杂交表明克隆1、克隆23、克隆94定位在染色体端部,克隆6定位在染色体的近着丝粒区。进一步设计引物利用PCR在基因组对四种序列进行扩增,并对扩增产物进行克隆及序列分析,获得4种重复序列重复单元长度分别为318bp、27bp、189bp和189 bp。利用开发出的染色体标记克隆1、克隆6、克隆94以及常用探针5SrDNA和45S rDNA为探针,对6个草地早熟禾品种的中期染色体进行鉴定,结果表明草地早熟禾染色体数目32~112不等,不同品种间以及同一品种不同个体间,染色体数目、不同染色体标记的数目以及组合形式不尽相同。进一步利用开发出的染色体标记对草地早熟禾近缘种青海扁茎早熟禾和青海冷地早熟禾中期染色体进行鉴定,结果表明有4个草地早熟禾染色体标记在扁茎早熟禾中与青海草地早熟禾无明显差异,但克隆6信号在青海冷地早熟禾中有明显差异。本研究开发出的染色体标记可作为揭示草地早熟基因组组成、不同品种及种质染色体特征以及揭示草地早地早熟禾无融合生殖的遗传规律的有力工具。
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