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色氨酸二聚体(Tryptophan Dimers，TDs)是一类重要的微生物次级代谢产物，因具有良好的生物学活性和药理活性受到广泛关注，代表化合物N-苯甲酰-星形孢菌素(midostaurin)已被批准用于治疗FLT3阳性的急性骨髓性白血病。Spiroindimicins和indimicins是一类具有中等抗肿瘤活性的TDs，分离自深海来源的链霉菌Streptomyces sp.SCSIO03032。与己报道的250多种TDs不同的是，spiroindimicins的双吲哚形成了独特的螺环结构，其中spiroindimicin A为5-6螺环，spiroindimicins B-D为5-5螺环，而indimicins结构中的一个吲哚环被甲基化而破坏了其芳香性。 本人硕士期间克隆鉴定了深海链霉菌Streptomyces sp.SCSIO03032中TDs生物合成基因簇（spm），通过基因敲除对其生物合成途径进行了初步研究，推测chromopyrrolic acid为其生物合成中间体。在此基础上，博士期间主要对spiroindimicins和indimicins生物合成后修饰基因进行了鉴定和功能研究，基本解析了从chromopyrrolic acid到spiroindimicins和indimicins的生物合成过程。取得了如下研究成果: (1)将spm基因簇克隆至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)和天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor YF11中进行表达，并从链霉菌异源表达工程菌株中分离获得4个TDs同系物9-12。将这些同系物喂养至丧失TDs生产能力的△spmO突变株，使其恢复了生产spiroindimicins的能力。随后，结合同位素喂养，基因簇异源表达和生物信息学分析，初步定位了分散在基因组不同位置的6个甲基转移酶，参与spiroindimicins和indimicins后修饰过程。分别对这6个甲基转移酶进行基因敲除，确认spmNMT1、spmNMT2基因参与spiroindimicins的生物合成后修饰过程，spmMT1、spmMT2、spmMT3、spmMT4基因参与indimicins的生物合成后修饰过程。 (2)spmNMT1蛋白催化的甲基化反应是负责合成spiroindimicins的关键步骤，其基因灭活突变株不能生产spiroindimicins，主要积累chromopyrrolic acid和indimicins。体外酶学研究表明SpmNMT1为不需要金属离子辅助的SAM依赖型氧甲基转移酶，负责TDs吡咯环上羧基侧链的甲基化，介导chromopyrrolic acid进入spiroindimicins合成途径。SpmNMT2蛋白具有两个结构域，分别为AdoMet_Mtases结构域和NADB_Rossmann结构域。spmNMT2基因敲除突变株不积累spiroindimicin B/D，而积累spiroindimicin A，indimicins和两个TDs同系物，证实SpmNMT2参与spiroindimicin B/D的生物合成后修饰，是催化合成5-5螺环结构的关键酶。通过体外酶学实验证实SpmNMT2的AdoMet Mtases结构域能够催化spiroindimicin C甲基化生成spiroindimicin B，但NADB_Rossmann结构域的功能暂不确定。 (3)通过基因大片段敲除实验证实spmMT1-4基因编码的4个甲基转移酶参与indimicins的生物合成后修饰过程，与spiroindimicins的生物合成无关。基因敲除和体外生化实验证明SpmMT1负责indimicins吡咯环上的碳甲基化。通过基因敲除实验推测SpmMT2负责吲哚环上的氮甲基化，SpmMT3和SpmMT4负责引起吲哚环芳香性被破坏的碳甲基化。从△spmMT4突变株中分离得到关键生物合成中间体化合物31，喂养实验表明化合物31能够转化生成终产物indimicin B/E，证实了我们对indimicins生物合成后修饰途径的推测。 (4)最后，通过生物信息学分析，获得了实验室另一株spiroindimicin B生产菌SCSIO11791中的TDs生物合成基因簇(slm)，并通过基因组序列比对，初步定位了参与spiroindimicin A后修饰过程中5-6螺环形成的细胞色素P450基因。 综上所述，本论文推导并证实了从chromopyrrolic acid到spiroindimicins和indimicins的生物合成后修饰过程，鉴定了参与后修饰过程的6个甲基转移酶基因，通过体内基因敲除和体外酶学实验对这些功能基因进行了验证。从突变株中分离鉴定了14个新的TDs类化合物，通过X-ray衍射和圆二色谱比对确定了部分化合物的绝对构型。另外，成功构建了spm基因簇在不同宿主中的表达体系，这些都为利用合成生物学改造、设计合成结构新颖的TDs提供了依据。