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吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids，PAs)是一类广泛存在于有花植物中的天然性植物毒素，有显著的急慢性毒性；其急性中毒的临床表现为肝脏的静脉闭塞症(veno-occlusive disease，VOD)，慢性毒性的典型特征为肝巨红细胞症(megalocytosis)和肝的纤维化坏死(cirrhosis)，因此PAs又被称为肝毒性吡咯里西啶生物碱(hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids，HPAs)。目前已发现了660多种PAs及其氮氧化物，95％集中在菊科(Compositae)、紫草科(Boraginaceae)、豆科(Leguminosae)、兰科(Orchidaceae)四大科中，其中菊科千里光属(Senecio)植物为其主要来源之一.千里光Senecio scandens Buch.-Ham.(SS)和欧洲千里光S.vulgaris L.(SV)同为菊科千里光属植物，前者为我国传统用药，在中药配方及复方制剂中被广泛应用，如中国药典收载的千柏鼻炎片中千里光的处方量达74%;后者在欧洲国家作为补剂或茶使用，但是在西班牙等许多国家引起了中毒甚至死亡事件，目前已被严格禁用。千里光和欧洲千里光亲缘相近，但在毒性／药效表现上差异显著，然而关于其化学成分以及毒性差异的原因目前尚未有系统的研究.
本研究以液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)为核心技术，对千里光、欧洲千里光及二者所含主要HPAs阿多尼弗林碱(adonifoline，ADO)和千里光碱(senecionine, SEN)的肝毒性进行比较研究，从植物次生代谢、毒物体内代谢、毒性代谢组学三个方面展开系统研究，对二者所含的主要毒性成分及有效成分进行化学分析及差异比较，并对二者所含的特征HPAs进行体内代谢研究，还对两种植物及其特征HPAs进行了代谢组学研究，以对两种植物的毒性差异进行综合评价。并在以上研究的基础之上，建立了千里光药材(Senecionis Scandentis Herba)的质量控制和安全标准，为更安全有效的利用此药材奠定了基础.
1，千里光和欧洲千里光植物次生代谢物差异研究
对二者所含的潜在毒性成分PAs及活性成分有机酸和绿原酸分别进行了比较研究，并进行差异分析.
建立了应用于毒性成分PAs的2种定性分析方法和2种定量分析方法.首先对千里光和欧洲千里光的生物碱部分进行了代谢组学分析，挖掘出两种植物之间差异最大的10个次生代谢物，鉴定其均为PAs（包括senecionine、senecionine-N-oxide、seneciphylline、retrorsine、retrorsine-N-oxide、adonifoline等），并发现adonifoline和senecionine分别为二者所含的特征PA.基于以上发现，我们建立了以柱前衍生化高效液相色谱法为基础的植物中RET型PAs的定量分析方法，RET-PAs与四氯苯醌反应，在甲醇体系中生成在223nm下有最大吸收的产物；该反应专属性强（仅与RET-PAs反应，对OTO-PAs和RET-PA-N-oxides均惰性），且对不同的RET-PAs对此反应具有高度的一致性(四个不同的RET-PAs反应标准曲线斜率的RSD小于3%)，然灵敏度较低，检测限为2ng，可满足一般情况下对毒性PAs的分析要求。然植物中所含PAs含量一般较低，故又建立了千里光和欧洲千里光特征PAs adonifoline和senecionine的UPLC-MS定量分析方法，方法快速(分析时间4.5min)、准确可靠（回收率在95%～104%之间），且灵敏度高比柱前衍生化方法提高了1000倍(LOQ为2pg)。此外，还建立了基于母离子扫描法的不同类型PAs的特征指纹谱研究方法，以实现对植物及制品中PAs的全面分析。以所建立方法对两种植物进行了分析，结果表明欧洲千里光中所含PAs的种类和数量都远比千里光丰富，在欧洲千里光中筛选出34个PAs化合物，包括15个RET-PAs，9个RET-PA-N-oxides，7个saturated RET-PAs，1个OTO-PA，以及2个dehydro-OTO-PAs，其中25个为毒性PAs;在千里光中筛选出18个PAs化合物，包括8个RET-PAs，3个RET-PA-N-oxides，6个saturatedRET-PAs，以及1个OTO-PA，其中12个为毒性PAs。另外，以adonifoline为外标对二者所含主要HPAs进行了相对定量分析，表明欧洲千里光中HPAs的含量约为千里光的25倍，而欧洲千里光中特征PAsenecionine的含量约为千里光中特征PA adonifoline含量的3倍。
建立了应用于非生物碱部分特别是有效成分有机酸和黄酮的1种定性分析方法和2种定量分析方法。对千里光和欧洲千里光非生物碱部分进行了HPLC-UV特征指纹谱分析，各表征出两种植物中包括绿原酸在内的11个指纹峰，且均为有机酸类（绿原酸类和原儿茶酸类）和黄酮类化合物，为千里光类药材的活性成分；该方法稳定、简便、可靠(以指纹峰相对峰面积及相对保留时间考察稳定性、精密度及重复性，各项RSD均小于5%)，符合指纹谱研究相关要求，可很好的对两种植物的差异进行表征。分别建立了千里光药材中金丝桃苷和绿原酸的HPLC定量分析方法，方法稳定可靠，适用性良好。分别以绿原酸和金丝桃苷为外标对千里光和欧洲千里光中有机酸和黄酮进行了相对定量分析，结果表明千里光中有效成分远高于欧洲千里光，前者所含有机酸和黄酮含量分别为后者的2和16倍.
2，阿多尼弗林碱和千里光碱大鼠体内代谢差异研究
对千里光和欧洲千里光所含两种特征性HPAs adonifoline和senecionine的体内代谢及代谢产物进行定性定量分析，有助于进一步了解HPAs体内的作用方式及可能的毒性机制。
分别建立了大鼠口服adonifoline和senecionine后生物样本中原型及代谢产物的LC-MSn检测方法及大鼠血清中adonifoline、senecionine及二者氮氧化物的UPLC-MS同时定量分析方法.该定量分析方法采用高氯酸沉淀蛋白再经C18固相萃取富集目标化合物，对原型生物碱和氮氧化物两类极性酸碱度差异显著的化合物均有较好的提取率，同时亦可大大降低背景噪声提高灵敏度；方法快速(5.5min内完成一次分析)、灵敏(LLOQ达12pg)、准确可靠（各化合物回收率在92%～113%之间），极大的满足了药代动力学研究对分析方法的高通量高灵敏度的要求。此外，还对大鼠分别口服adonifoline和senecionine后尿液、胆汁、粪便、血清样本中的代谢产物进行了全面的研究，二者代谢模式相似，均经历还原、羟化、氮氧化、水解、谷胱甘肽结合等过程；但后者的代谢更加活泼，代谢产物更加丰富(39个vs19个)。分析原型生物碱及其主要代谢产物在各生物样本中的相对含量，senecionine转化为其氮氧化物的程度明显高于adonifoline转化为其氮氧化物的程度，senecionine氮氧化物在尿液、胆汁、血清中的总含量分别为36%、80%、41%，然而在粪便样本中未检测到；而adonifoline在各生物样本中绝大部分均以原型生物碱形式存在，在尿液、粪便、血清中相对含量均在80%以上，胆汁中相对含量为59%。
3，千里光／欧洲千里光和阿多尼弗林碱／千里光碱的代谢组学差异研究
建立大鼠血清内源性物质代谢组学研究方法，包括代谢指纹分析及溶血磷酰胆碱酯类化合物等代谢轮廓分析，并对大鼠给服千里光／欧洲千里光、adonifoline/senecionine后内源性化合物的变化进行研究。
首先建立了千里光／欧洲千里光、adonifoline/senecionine的体内外毒性模型并对其进行毒性评价，体内外实验LD50及IC50数据、肝组织病理切片、临床血清生化值等各方面的结果表明，欧洲千里光及其特征HPA senecionine的作用模式类似，有显著的肝毒性，所致损伤类型为胆汁淤积损伤和肝细胞实质性损伤兼有的混合型损伤；千里光和其特征HPA adonifoline的作用模式相似，毒性较弱或未显示明显毒性.再对大鼠口服千里光／欧洲千里光药材提取物、adonifoline/senecionine后血清内源性物质进行代谢指纹分析，发现胆汁酸类(如甘氨氮酸(glycocholic acid, G-CA)、胆酸(cholic acid，CA)、熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)、脱氧胆酸(deoxycholic acid, DCA)、甘氨石胆酸(glycolithocholic acid，G-LCA)、牛磺熊脱氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，T-UDCA)、牛磺胆酸(taurocholic acid, T-CA)、氨基酸类(如缬氨酸(valine，Val)、色氨酸(tryptophan, Try)、溶血磷酰胆碱酯类(如LPC(16:0/0:0)、LPC(18:0/0:0)等化合物可作为含PAs药材及PAs所致损伤的潜在生物标记物。在代谢指纹研究的基础上，对各给药组动物血清进行胆汁酸、氨基酸、溶血磷酰胆碱酯等各类特征生物标识物的代谢轮廓分析，表明欧洲千里光及senecionine给药组大鼠的胆汁酸系统受到的影响较大，大部分胆汁酸含量均有显著升高，特别是牛磺酸结合型胆汁酸，此外游离胆汁酸也有显著升高；千里光组和adonifoline对胆汁酸系统影响较小，主要是甘氨酸结合型胆汁酸的升高.在氨基酸代谢网络分析方面，给药组可见大部分氨基酸显著变化，其中牛磺酸(taurine，Tau)、精氨酸(arginine, Arg)在欧洲千里光组及senecionine组中显著下降；甲硫氨酸(methionine，Met)代谢通路上的甲硫氨酸／半胱氨酸(cysteine, Cys)及甲硫氨酸／牛磺酸的比值在欧洲千里光组及senecionine组中均显著高于其对应的千里光组和adonifoline组。另外，在口服千里光及adonifoline的大鼠血清中磷酰胆碱酯(phosphatidylcholines，PCs)/溶血磷酰胆碱酯(lysophosphatidylcholine，LPCs)比值显著下降，而给服欧洲千里光及senecionine的大鼠血清中该比值显著升高。
4.千里光药材质量标准的建立
基于以上研究结果，以黄酮类成分金丝桃苷为指标建立了千里光药材的质量控制标准，规定其含量不得低于0.030%;以HPA adonifoline为指标建立了千里光药材的限量检查标准，规定其含量不得超过0.004%。此标准并为2010版中国药典收载，为千里光药材的有效性和安全性提供了参考依据。
综上，本论文针对中药的“毒性”这一引起国际社会广泛关注且对我国中药产业的发展至关重要的问题，采用中药学、生物学、化学、信息科学等多学科技术综合评价了千里光、欧洲千里光的毒性差异，揭示了HPAs致毒的科学本质，并为保证千里光药材临床用药的安全有效，推进我国中药产业的现代化、国际化和中药经济的健康发展提供科学依据，亦为其他中药的毒性研究提供新的研究思路和方法。