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骆驼蓬属(Peganum)为蒺藜科(Zygophyllaceae)多年草本植物。全世界共有6种和1变种，在中国西北部分布骆驼蓬（P. harmala Linn.）、多裂骆驼蓬(P. multisecrum(Maxim) Bobr)及骆驼蒿(P. nigellastrum Bunge.)3个种。骆驼蓬是维吾尔、蒙古族民间沿用已久的药材，已被列入维吾尔药卫生部药品标准维吾尔分册。骆驼蓬植物的主要化学成分为生物碱（β-咔啉类生物碱和喹啉类生物碱），具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、抑制单胺氧化酶(MAO)活性、镇痛、抗菌、抗原虫及对中枢神经系统、心血管系统和肌肉离子通道等多方面药理作用。近年来发现骆驼蓬生物碱具有较好的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性，体外实验表明骆驼蓬中多个生物碱都具有与阳性药加兰他敏相近的抑制活性。在民间骆驼蓬种子和骆驼蓬草主要用于治疗咳嗽气喘、无名肿痛和偏瘫健忘等症。然而活性较强的β-咔啉类生物碱具有一定的毒副作用，主要体现在对中枢神经系统的毒性。
前期实验和文献报道发现口服骆驼蓬提取的总生物碱能引起人或动物震颤、运动失调、兴奋等神经性中毒症状。β-咔啉类生物碱广泛存在多种植物和食品中，更需要注意的是，β-咔啉类生物碱也常常存在正常人体组织脏器和体液中。鉴于β-咔啉类生物碱来源的多重性和广泛性，此类生物碱可从多种途径进入生物体内，后经过代谢发生理化性质的变化，从而引起药理活性和毒理活性的改变。而早期对此类生物碱的代谢研究主要采用薄层和高效液相色谱等技术，这些技术相比目前代谢分析的常用技术液质联用技术等存在一定的缺陷。药用植物骆驼蓬的主要药用部位为种子和全草。但作为最为常用的药用部位种子用肉眼无法识别。不同种骆驼蓬属植物分布区域存在一定的差异性，极有可能在不同地区的用药中存在品种选择的随意性。另外，不同品种骆驼蓬属植物中化学成分的差异、活性及毒性的差异，势必导致用药达不到治疗效果或者产生毒性，对用药的安全性产生较大的影响。
本论文针对以上几个问题，从以下几个方面进行研究，为制定安全合理的用药方案提供依据，为骆驼蓬属植物的安全合理的利用提供一定的科学基础：以骆驼蓬属植物(包含一个新发现的变种或新种P. variety)的活性成分生物碱为研究对象，对其的抗AChE和BChE活性及生物碱的毒性进行比较研究，并进行构-效（毒）关系分析；采用LC-MS和NMR技术对活性成分骆驼蓬碱harmaline和去氢骆驼蓬碱harmine的体内外代谢进行研究，明确其体内代谢通路；对4种骆驼蓬属植物从形态学、分子生物学、化学成分三个方面进行品质评价研究，在以上研究的基础上起草质量标准，并结合活性及毒性数据规定骆驼蓬药材的用法用量。通过以上研究，为骆驼蓬生物碱的新药研究开发和药材质量控制奠定基础，对保证骆驼蓬药材用药的安全、有效性及新药开发具有重要的意义。主要研究内容和结果如下：
1、骆驼蓬属植物生物碱活性及毒性评价
采用改良Ellman法定量检测和评价骆驼蓬属植物中主要生物碱类成分对乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BChE)抑制活性(IC50值)，并根据化合物的结构性质与IC50值的关系进行构-效关系分析。结果表明：骆驼蓬中的β-咔啉类生物碱和喹唑啉类生物碱对AChE和BChE均表现出较强的抑制活性。其中的哈尔满碱(Harmane)、去氢骆驼蓬碱(harmine)、骆驼蓬碱(harmaline)、鸭嘴花碱(vasicine)、哈尔醇(harmol)、哈吗酚(harmalol)及NigellastrineⅡ和NigellastrineⅠ对AChE抑制活性的IC50值分别为4.59±3.84、9.05±1.08、10.58±2.01、13.68±1.25、21.58±1.39、27.88±1.13、40.46±1.09和70.50±1.14μM，对BChE抑制活性的IC50值分别为76.91±1.57、75.07±1.29、101.39±1.39、8.21±3.65、9.48±2.03、2.60±1.47、9.26±1.47和18.24±3.23μM。而其它的生物碱衍生物如脱氧鸭嘴花碱(deoxyvasicine)、脱氧鸭嘴花酮碱(deoxyvasicinone)、鸭嘴花酮碱(vasicinone)、及1，2，3，4-Tetrahydroharmane-3-carboxylic acid等对两种胆碱脂酶的抑制活性相对较差。经过初步的构-效关系分析表明，β-咔啉类生物碱7号位置的取代基对AChE的抑制活性有较大的影响。此位点的取代基的氧化程度对活性影响较明显，甲氧基取代后使抑制AChE的活性下降，若将氧暴露，如羟基取代使抑制AChE的活性下降更加明显，而BChE的抑制活性增强，使其对AChE和BChE的抑制活性的选择性变差。喹啉类生物碱中只有鸭嘴花碱(vasicine)有较强的抑制胆碱脂酶的活性，但是此化合物对AChE和BChE的抑制无选择性。3、9位推测为此类化合物的活性位点，3位羟基取代和9位羰基化使此化合物的抗胆碱酯酶的活性消失。β-咔啉的母核和喹啉母核连接得到的二聚体化合物nigellastrineⅠ和nigellastrineⅡ与其β-咔啉类母体化合物相比，其对BChE抑制活性的选择性得到了相对提高。
对4种骆驼蓬属植物种子进行急性毒性测定，结果表明骆驼蓬属不同种植物种子总碱提取物中生物碱类型和含量与其急性毒性(LD50)的大小直接相关。尤其是骆驼蓬碱(harmaline)和去氢骆驼蓬碱(harmine)含量的大小及其比例与急性毒性数据的大小(LD50)具有良好的相关性。骆驼蓬碱(harmaline)的含量越高，其毒性越大。
通过活性及毒性的比较研究，探讨不同种属骆驼蓬植物用药的安全性和有效性，为药品标准中收载的药用品种骆驼蓬能否被其它品种替代、为骆驼蓬种子药材质量标准的研究与制定提供了依据。为了尽量降低药物的毒性，在后续药物开发中应重视活性成份的结构修饰和改造，着重提高药物作用靶点的选择性。
2、骆驼蓬生物碱的体内外代谢研究
本论文采用HPLC-MSn和NMR技术与方法对骆驼蓬碱(harmaline)和去氢骆驼蓬碱(harmine)的代谢产物进行鉴定，阐明2种生物碱的体内代谢通路。首先采用人肝微粒体和大鼠肝微粒体进行体外代谢研究，harmaline和harmine在体外人肝微粒体Ⅰ相代谢途径主要是7位O脱甲基、羟基化（羟基位点未定）这两种途径。而Ⅱ相代谢产物主要为7位O脱甲基产物去甲骆驼蓬碱(harmalol)和哈尔醇(harmol)的7位OH进行葡萄糖醛酸化。在大鼠尿液中发现了9个harmaline的代谢产物(M0、M1、M4-M9、M11)和7个harmine的代谢产物(M4、M5、M7-10、M12)。通过对尿液中的代谢产物进行分离纯化，得到4个代谢产物(M7、M8、M9、M12)，并通过NMR法鉴定了代谢产物的结构分别为哈尔醇-7-氧-β-D-葡萄糖醛酸苷、去氢骆驼蓬碱-5-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、哈尔醇-7-磺酸基、3-羟基-7-磺酸哈尔醇。通过4个Ⅱ相代谢产物研究，首次明确了harmaline和harmine代谢代谢过程中的两个羟基化位点(3位和5位羟基化)。值得注意的是，我们通过HPLC-MS检测代谢产物的量和代谢产物结构的鉴定，首次证明了harmaline在大鼠体内能够脱氢氧化生成harmine，继而代谢成其它代谢产物，为一条重要的减毒增效代谢途径。
药物代谢性相互作用研究在药物研究中具有重要的作用。对于中药及植物药来说，其中所含成分对P450酶的抑制作用或诱导作用研究，对预测所含成分间及其与其它药物联合使用时的潜在药物相互作用具有重要的意义。本论文通过混合人肝微粒体检测β-咔啉类生物碱(harmaline、harmine、harmalol、harmol和harmane)对人P450酶催化探针底物反应活性的影响，并确定其抑制类型。酶抑制动力学研究表明Harmine、harmol和harmane抑制人CYP3A4活性的半数抑制量分别为44.07±1.07、2.45±1.08和0.73±1.06μM，抑制常数Ki分别为16.76、5.13和1.66μM，且其抑制类型为非竞争型抑制，Harmaline及其代谢产物harmalol对CYP3A4几乎没有抑制活性。Harmaline、harmine和harmol对CYP2D6呈现出中等强度的抑制活性，其半数抑制量分别为26.16±1.57、39.30±1.17和45.32±1.68μM，酶抑制动力学研究表明其为竞争型抑制，抑制常数分别为20.69、36.48和47.11μM，代谢产物harmalol和harmol对CYP2D6的抑制活性都要弱于原型化合物harmaline和harmine，这些实验结果说明化合物对酶活性抑制作用的强弱可能会受体内代谢情况的影响.此研究数据显示大部分β-咔啉类生物碱对CYP3A4和CYP2D6具有中低强度的抑制，只有harmane和harmol这两个生物碱对CYP3A4有很强的抑制活性。以上体外研究结果对预测β-咔啉类生物碱在体内对P450酶的影响具有重要的作用。
3、不同骆驼蓬植物种子类药材的品质评价研究
药用植物骆驼蓬的主要药用部位为种子和全草，在民间用药存在不同骆驼蓬属植物混用的现象。其它3个种的骆驼蓬属植物能否代替药用种骆驼蓬，是一个值得深入研究的问题。从药效及毒性数据分析发现，不同种的骆驼蓬属植物的药效和毒性具有较大的差异。鉴于用药的安全性，对存在混用的骆驼蓬属几种植物进行鉴别是十分必要的。
首先，采用最常用的形态学鉴定，使用光镜和电镜技术观察植物的形态，原植物形态和种皮纹饰能够很好的区分鉴定骆驼蓬P. harmala、多裂骆驼蓬P. multisectum、骆驼蒿P. nigellastrum和变种P. variety。变种P. variety和其它种有明显的差异，原植物形态和种皮纹饰和多裂骆驼蓬更为接近，与骆驼蓬P. harmala和骆驼蒿P. nigellastrum有较明显的差异，据此可以推断变种P. variety为一个新种或一过渡种。
其次，从分子角度，首次采用现代分子生物学技术-分子标记技术，选择进化较快，适合用于鉴别属以下的基因片段trnL-F和psbA-trnH基因片段对骆驼蓬属植物的种属关系进行研究，能够很好的区分骆驼蓬P. harmala、多裂骆驼蓬P. multisectum、骆驼蒿P. nigellastrum，其中多裂骆驼蓬P. multisectum的系统关系与其它种的关系最远。基于分子生物学数据证实多裂骆驼蓬P. multisectum为一个独立的种，而非骆驼蓬P. harmala的变种，变种P. variety也能够鉴定为一个独立的新种或一过渡种，其关系与骆驼蒿P. nigellastrum较为接近。
最后，从化学分析的角度，采用TLC和HPLC指纹图谱技术对骆驼蓬属植物的化学成分进行分析。TLC指纹图谱简单、快速、高通量的特点可对不同品种的骆驼蓬属植物进行定性鉴别，结合TLC-生物自显影技术可在发挥鉴别作用的同时，可以直观地反映出不同样品中活性指标成分的抗乙酰胆碱酯酶活性的强弱，达到中药活性筛选与品质评价两个目的。建立了骆驼蓬属植物种子药材的HPLC指纹图谱，通过对23批骆驼蓬P. harmala、24批多裂骆驼蓬P. multisectum、9批骆驼蒿P. nigellastrum和12批骆驼蓬变种P. variety样品的HPLC化学指纹图谱进行分析，建立了4个不同品种的特征指纹图谱。对68批样品的HPLC指纹图谱进行相似度分析、聚类分析、主成分分析和判别分析，结果发现HPLC指纹图谱能够有效的区分4个不同品种的药材样品，结果与形态学鉴别分析的结果相符，骆驼蓬变种P. variety表现出与多裂P. multisectum的系统关系更为接近。结合分子生物学的鉴定结果，进一步表明骆驼蓬变种P. variety为一个独立的新种或者一个过渡的变种。
在药效学、毒性实验和代谢研究的基础上，选择骆驼蓬碱(harmaline)和去氢骆驼蓬碱(harmine)为指标成分，建立了HPLC-DAD定量分析方法，并对不同产地41批骆驼蓬P. harmala、11批骆驼蒿P. nigellastrum、25批次多裂骆驼蓬P. multisectum及12批的骆驼蓬变种P. variety样品中的骆驼蓬碱(harmaline)和去氢骆驼蓬碱(harmine)的含量进行了分析测定。结果表明，骆驼蓬、多裂骆驼蓬、骆驼蒿和骆驼蓬变种植物种子中harmaline的含量分别为3.281±0.493％、2.757±0.394%、4.313±0.722%和4.466±1.034%；harmine的含量分别为4.089±0.898%、1.253±0.388%、0.083±0.197%和0.845±0.302%;总生物碱含量（harmaline与harmine之和）分别为7.364±1.254%、3.957±0.573%、4.389±0.661%和5.311±1.189%;harmine与harmaline含量的比值分别为1.250±0.221、0.469±0.155、0.022±0.060和0.192±0.069。从含量测定结果可以看出，不同种属的种子中总生物碱含量、单体成分含量及harmine与harmaline含量的比值均存在显著性差异。进一步经过对不同品种骆驼蓬属植物种子中指标成分的含量测定数据（harmine和harmaline、2种生物碱的总含量及harmine与harmaline含量的比值）进行聚类分析和主成分分析，结果发现，用harmine与harmaline两个主要活性成分的含量为参数，即可将法定药用品种骆驼蓬种子与其它3个种的骆驼蓬属植物种子实现有效的区分与鉴别。进一步说明了选择骆驼蓬碱(harmaline)和去氢骆驼蓬碱(harmine)为指标成分的重要性及其意义。
4、骆驼蓬种子药材质量标准
中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册骆驼蓬药材的质量标准只收载了种子的显微鉴定，没有完整的药材定性、定量鉴别方法，显然不能全面反映骆驼蓬药材的内在质量。本论文在药效活性和毒性评价的基础上，分别以harmaline和harmine为指标成分，建立了骆驼蓬药材的HPLC含量测定方法，并建立了TLC和HPLC指纹图谱用于评价骆驼蓬药材，起草了质量标准（草案）。
根据41批不同居群骆驼蓬药材的含量测定结果，hannaline平均含量为3.281%、harmine平均含量为4.089%、总生物碱平均含量为7.364%。规定骆驼蓬种子按照干燥品计算，harmaline的含量2.624%-3.936%、harmine的含量3.271%-4.907%、总生物碱含量5.891%-8.837%。由于骆驼蓬的活性生物碱既为活性成分又为其毒性成分，根据小鼠毒性数据根据种属剂量换算，harmaline的平均含量计算人每日摄取骆驼蓬种子不得超过4g，而以harmine的平均含量计算人每日摄取骆驼蓬种子不得超过8g。而标准中规定骆驼蓬种子的用量为4-8g，与本实验的结果相符合，为安全用药提供了一定的理论依据。
总之，此论文对骆驼蓬从生物活性、毒性、活性成分的代谢、品质评价等方面进行了系统的研究，为后期药用植物骆驼蓬的开发与利用奠定了一定的基础。