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本文利用RT-PCR和RACE技术,克隆分离了金钗石斛KNOX基因eDNA全长序列,并且通过半定量RT-PCR分析了其在不同器官的表达模式以及低温和激素处理后对其表达的影响主要研究结果如下:
(1)以金钗石斛类原球茎(PLBs)为实验材料,根据Genbank上KNOX同源基因序列,应用RT-PCR和RACE的方法,克隆了KNOX同源基因的cDNA全长序列,命名为DNKNOX1,Genbank登陆号为AY608889。该基因长1282bp,5’非翻译区(5’-UTR)与3’非翻译区(3’-UTR)分别为70 bp和348 bp,包含了完整的ORF。ORF全长864bp,编码287个氨基酸,其中含有35个强碱型氨基酸(K、R),50个强酸型氨基酸(D、E),95个疏水氨基酸(A、I、L、F、w、V)和60个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。根据序列信息推测的蛋白质等电点为4.92,相对分子量为32.1 kDa。
(2)对DNKNOX1基因推测的蛋白质进行保守区分析,表明DNKNOX1具有保守的同源异型盒蛋白特征,有3个保守区,分别是KNOX1、KNOX2和Homeodomain。与Genbank上的保守区蛋白库比对,DNKNOX1蛋白的三个保守区中,KNOX1、KNOX2保守区的保守性较强,分别为83%和75%;而与 Homeodomain保守区的同源性为52%,Homeodomain保守区包含三个螺旋区和一个转角区,对螺旋Ⅰ更进一步分析确定本试验所克隆得到的基因为第一类KNOX同源基因,提示DNKNOX1基因可能是通过抑制目的基因的表达而发挥功能的。对DNKNOX1基因推测的氨基酸序列进行同源性比对,结果显示:与秋石斛KNOX基因DOH1的同源性最高达96%,与烟草KNOX基因的同源性较低31%,与拟南芥,牵牛花,番茄,水稻的同源性分别为在41%至58%之间。
(3)以金钗石斛ACTIN基因作为内参照,通过半定量RT-PCR检测DNKNOX1基因在金钗石斛不同器官以及低温和激素处理对其表达的影响。未见 DNKNOX1 基因在茎和侧萼中表达,在类原球茎、根、叶、花瓣、合蕊柱、中萼、唇瓣中都有表达,但表达量差异不大;在低温(4℃)处理的类原球茎中,刚开始正常表达,处理第6天末见表达,第8天又回复表达,第10天末见表达,低温(4℃)处理对根和叶中DNKNOX1基因的表达不受影响,与常温下一样,未见在茎中表达;TDZ(20 mg·L-1)诱导花芽形成的不同时期中,DNKNOX1的表达末见明显差异。