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昆虫抗微生物肽(Insect antimicrobial peptide)是昆虫免疫诱导产生的一系列抵抗微生物侵染的小分子多肽,在昆虫先天免疫中起到重要的作用.编码这些抗微生物肽的基因在基因组中大多数以多基因家族(Multi-gene family)的形式存在着.在过去的研究中,尚未关注到这些多基因家族成员之间的抗菌活性差异和诱导表达差异的问题.对此问题的研究,将有助于解析抗微生物肽基因家族进化及其功能分化的关系,以及抗微生物肽分子结构与功能的关系,并能揭示昆虫抗微生物肽的免疫诱导模式和昆虫的抗病机制.
家蚕基因组存在着包括溶菌酶基因在内的编码七大类抗微生物肽或抗菌蛋白Cecropins、Moricins、Attacins、Enbocins、Gloverins、Lebocins和Lysozyme的基因群,除了Lysozyme外,编码其他六大类的抗微生物肽的基因形成多基因家族.2004年家蚕基因组发布并注释了众多的抗微生物肽基因,然而这些新注释的基因的生物学功能有待进一步深入研究.本文对家蚕基因组中新注释的属于编码Cecropins、Moricins、Attacins 3个基因家族中12个基因成员以及相应基因家族中的3个已知基因共15个基因的抗菌功能和诱导活性进行了研究,希望为验证关于昆虫抗微生物肽基因家族可能存在主基因免疫诱导模式的假设提供实验证据。
本论文研究内容主要有四方面:第一是对家蚕编码Cecropins基因家族的6个基因成员(BmcecB1、Bmcec lC、BmcecA2、BmcecE、BmcecD1、BmcecD2)、Moricins 族的5个基因成员(BmmorA1、BmmorA2、BmmorB1、BmmorB2、BmmorB4)、Attacins 族的1个基因成员Bmatt1和3个A已知功能的对照基因(家蚕Cecropins族的Cecropin D、烟草天蛾Moricins族的Msmor和家蚕Attacins族的Nuecin)进行了克隆表达和分离纯化；第二是采用5种革兰氏阳性菌和5种革兰氏阴性菌作为受试菌,分别以琼脂板孔穴扩散法和最小抑菌浓度法(MIC)对15个靶基因的表达产物进行抗菌谱和抗菌活性的功能鉴定；第三是对家蚕CecropinA亚族、D亚族、E亚族的代表基因进行实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)的诱导转录活性检测和分析；第四是初步讨论和分析家蚕Cecropins、Moricins基因家族可能存在的主基因免疫诱导模式的特征.研究获得的主要结果如下:
1)从诱导家蚕蛹中获得属于三个基因家族共15个基因并获得正确的克隆,成功地构建了属于这15个基因的大肠杆菌超表达系统,表达并纯化出可供抗菌活性检测的15个同系物。
2)家蚕Cecropins族同系物的抗菌活性及其基因的诱导转录活性差异为:Bmcec 1C和BmcecD2并没有对供试菌显示出抑制作用,其他5个基因的抗菌谱和抗菌活性表现为:Cecropin D≈BmcecB1>BmcecA2≈BmcecE>BmcecD1,它们的抗菌谱显示出较强的抗革兰氏阴性菌活性以及弱的抗革兰氏阳性菌活性；编码Cecropin A、Cecropin B、Cecropin D、Cecropin E亚族基因的诱导转录活性差异为:Cecropin D≈BmcecB1-B5>BmcecA1/A2>BmcecE,而在BmcecD1上则几乎检测不到诱导转录活性；从Cecropin D和BmcecB1最强的抗菌活性和Cecropin D和BmcecB1-B5最高的转录活性的实验结果可以推测,在Cecropins基因家族中可能存在着主基因诱导模式,Cecropin D和BmcecB1-B5亚族基因在家蚕Cecropins基因家族中起着主导的作用；而未能检测到BmcecD1的诱导转录的原因可能与该基因上游序列缺乏NF-κB-like、GATA、R1元件匹配的位点有关.
3)家蚕Moricins族同系物基因:2个Moricin A亚族基因BmmorA1和BmmorA2和对照基因Msmor(烟草天蛾)的抗菌谱和抗菌活性差异为:BmmorA1>Msmor>BmmorA2；Moricin A亚族的抗菌特征可能代表了家蚕Moricins族的抗菌特征；3个Moricin B亚族基因BmmorB1、BmmorB2、BmmorB4分别代表了B亚族的2个分支,它们对所有供试菌都无抑菌作用；家蚕Moricin A亚族基因(BmmorA1-A4)具有强诱导活性,结合BmmorA1和BmmorA2具有较强的抗菌活性,推测在Moricins族中Moricin A亚族基因可能起着主导的作用.
4)家蚕Attacins族同系物基因:采用琼脂板孔穴扩散法定性测定家蚕Attacins族同系物Bmatt1和Nuecin的抗菌活性结果显示,Bmatt1与Nuecin具有相似的抗菌谱,主要表现为对革兰氏阴性菌的抑制活性.
本论文的研究结果进一步验证并支持了从基因家族信息学的分析所得到的假设:即昆虫抗微生物肽基因家族可能存在主基因免疫诱导模式.实验结果还加深了对这三个基因家族的分子进化以及功能分化的理解,并为由复制而来的新基因的命运提供了新的实验数据。