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青篱竹族(Arundinarieae),即温带木本竹类,隶属于禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae),包含20余属600多种,该族的单系得到强烈支持,但其内部划分因其种类繁多、形态性状复杂多变且有花标本较难获取而存在着很大争议,分子系统学的引入表明经典分类学确定的亚族及绝大多数的属都不为单系。在广泛取样和多个叶绿体分子片段的基础上,最近的分子系统学研究将青篱竹族分成了十个主要分支,但是十个分支之间及其内部的关系大多没有得到解决。本研究是在这十个分支的基础上旨在利用叶绿体系统发育基因组学的手段来解决主要分支之间的关系。利用第二代测序技术Illumina成功测序获取了竹类的叶绿体基因组,同时发现这种测序方法还有可能获得相应的线粒体基因组序列。本研究共完成了代表七个主要分支的19种温带木本竹类以及1种热带木本竹类的叶绿体基因组,以多种方法构建了系统发育树,并推断了青篱竹族的起源与分化时间。主要的研究结果如下:
1.利用Illumina测序技术测序叶绿体基因组
植物叶绿体DNA常难以提取分离,利用改良的高盐低pH方法成功提取了达到测序要求的DNA,通过测序6种竹类发现虽然叶绿体DNA的含量在总的提取DNA中只占大约12-26%,但凭借第二代测序仪高通量的优势可以较容易获得大量数据,经过拼接得到了几乎完整的叶绿体基因组序列,并且拼接序列的准确性在传统Sanger测序方法中得到了很好的验证。利用Illumina测序技术测定竹类叶绿体基因组是一种行之有效的方法。
2.裂箨铁竹(Ferrocalamus rimosivaginus)线粒体基因组及禾本科线粒体基因组进化速率分析
在利用Illumina对叶绿体基因组进行测序时,发现测序序列中包含大量来自线粒体基因组的序列。选取裂箨铁竹(Ferrocalamus rimosivaginus)的测序序列进行拼接,利用PCR技术以Sanger测序方法做了大量的补洞及验证工作,得到了一个较为完整的线粒体基因组,大小为432,839 bp,并且其序列准确性也得到了很好的验证。现有禾本科线粒体基因组所共有的基因都在序列中得到了注释。利用31个线粒体蛋白质编码基因构建了21种被子植物系统发育树,系统关系得到了很好的解决,同基于叶绿体DNA序列的系统发育关系基本一致。然而在禾本科BEP分支的单系问题上两者却产生了明显的冲突,线粒体DNA系统树不支持BEP分支的单系,这同现有的认识相背离。通过将31个线粒体基因分为12个进化速率相对较快和19个进化速率相对较慢的基因分别加以分析,并基于31个基因的氨基酸序列构建系统树发现这-冲突可能是由线粒体DNA系统树中的长枝吸引(long-branch anraction,LBA)所造成的。利用己推测的起源分化时间,发现在禾本科分化之前线粒体基因序列进化速率约为禾本科分化之后进化速率的4倍。此外,揭示的禾本科线粒体基因组的进化模式同其叶绿体基因组的进化模式十分相似。
3.青篱竹族的叶绿体基因组
青篱竹族叶绿体基因组具有典型的被子植物叶绿体基因组的四分体结构,19种叶绿体基因组在基因组大小、GC含量等基因组结构上高度保守,编码着相同数目的131个基因,并且基因的排列顺序都保持一致。青篱竹族叶绿体基因组具有极低的分子进化速率,在19种叶绿体基因组中共发现了14个小的倒位(inversion),DNA序列中的插入(insertions)突变发生的频率远大于缺失(deletions)突变发生的频率。
4.青篱竹族的系统发育关系
以3种热带木本竹类为外类群及代表青篱竹族十个分支中七个分支的19种竹类作为研究类群,基于全叶绿体基因组序列进行了详尽的系统学分析。虽然叶绿体基因组非编码区所包含的信息位点大约为编码区的两倍,在深度分支关系上二者几乎给出了相同程度的解决,但是在分支内部系统关系上非编码区序列要优于编码区序列,不同进化速率的分子片段具有解决不同深度系统发育关系的能力。在对叶绿体基因组不同区域即大单拷贝区、小单拷贝区和反向重复序列区进行系统学分析时没有发现得到很高支持且相互冲突的系统关系。此外,在对以上5组数据进行的最大简约法(maximum parsimony,MP)、最大似然法(maximum likelihood,ML)和贝叶斯法(Bayesian inference,BI)三种分析方法中得到的系统关系也高度一致。在极短内部枝长和高度异质性进化速率的情况下,同上述5组数据相比青篱竹族系统发育关系在全叶绿体基因组序列分析中得到了最大程度的解决,系统树拓扑结构在不同的核苷酸分子进化模型和数据partitioning条件下基本保持一致,绝大部分分支之间以及分支内部的系统关系都得到了解决,具有极高的支持率,并且排除了长枝吸引等可能的系统误差。保守的插入与缺失突变在19种温带木本竹类中的分布与基于序列所构建的系统关系基本一致,进一步证实了所揭示系统发育关系的可靠性。虽然叶绿体系统发育基因组学在解决温带木本竹类系统发育关系上显现出了巨大优势,但是在系统树上仍有两处的系统关系没有得到解决。第一,温带木本竹类基部类群的系统关系,除去遗传距离较远的外类群所产生的影响外,青篱竹族快速辐射进化过程中可能的不完全谱系分选(incomplete lineage sorting)所导致的相互冲突的系统信息应是这一关系没有得到解决的主要原因。第二,第V分支中亚分支内部的系统关系没有解决,这一问题可能是由快速辐射进化而形成系统关系上的hard polytomy所引起的。揭示的主要分支之间的系统关系为第Ⅲ分支和第Ⅸ分支为姐妹群,之后同第Ⅴ分支和第Ⅶ分支构成的单系类群又构成了姐妹群的关系。总之,虽然青篱竹族的快速辐射进化给其系统发育关系的解决带来了前所未有的困难,利用叶绿体系统发育基因组学手段较好的解决了主要分支之间的关系,构建了青篱竹族整体性的系统发育框架,为以后的研究奠定了基础。
5.青篱竹族的起源与分化时间
在没有相关化石证据提供信息的情况下,对青篱竹族的起源与分化时间的推断依靠三个次级标定点(secondary calibration)的时间信息。两组不同的时间设置所得到的结果几乎一致。青篱竹族起源较早,在始新世中后期或渐新世早期,但是在起源之后相当长的一段时间内并没有发生分化,开始分化的时间大约为7 Ma,并且各主要分支在短短的2个百万年之内便分化形成,这一时间尺度同已有的快速辐射进化类群分化形成的时间尺度相当。这一时期正处于中新世的晚期,青篱竹族的快速辐射分化可能同这一时期的全球气候变冷事件密切相关。青篱竹族内部第Ⅴ和Ⅵ分支可能在第四纪经历了相似的快速辐射进化过程。这与其现今更加适合较寒冷的气候相吻合。
6.青篱竹族的快速辐射进化
现有温带木木竹类类群其地理分布范围十分广泛,种类繁多,具有高度多样化的生境和形态特征,并且这一类群可能经历了不止一次的快速辐射进化。归纳起来温带木本竹类可能是一个起源相对古老、近期快速辐射分化、物种正在形成的特殊类群,具有十分复杂的进化历史。