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背景与目的核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一种几乎表达于所有细胞的蛋白复合体。Sen等1986年首次在成熟B细胞,浆细胞中发现的能与免疫球蛋白K轻链增强子B点特异结合的核蛋白,并能促进K基因表达的核蛋白因子。NF-κB几乎存在于所有的细胞中。NFκB家族包括NF-κB1 (P50), NF-κB2 (P52), RelA(p65),RelB和c-Rel等,其共同点是拥有一个有300个氨基酸组成的高度保守的Rel同源结构域,该区为与DNA结合、二聚体化、I K B相互作用及核定位信号区域。在胞浆中NF-κB与一种抑制性蛋白I K B结合处于失活状态,能被激活剂如TNF,生长因子,氧化剂,病毒,药物等激活。被激活的κB与NF-κB抑制蛋白(I K B)解离,转入核内与靶基因的K B序列结合,增强其表达。NF-κB是一类功能广泛的核转录调控元件,通过对靶基因的调控,参与机体的免疫,炎症,肿瘤的发生,细胞周期调控及凋亡等多种生物学过程。研究显示NF-κB导致恶性肿瘤的发生是因为细胞因子或其受体基因转录的激活,促进了非调节性淋巴细胞的生长或阻断凋亡。此外,NF-κB直接作用于细胞周期或DNA复制也会导致恶性肿瘤的发生。体外实验表明,抑制NF-K B能促进肿瘤细胞发生凋亡。近年研究发现,在急性髓系白血病(AML)患者存在持续活化或高活性的NF-κB,且AML患者NF-κB活性与其亚型有关。应用定量PCR方法检测AML患者NF-κB mRNA表达情况,国内未见报道。本实验通过实时定量PCR的方法比较正常人及AML患者NF-κB mRNA表达水平差异,探索其在AML发病中可能的作用机制。对象与方法1研究对象：60例病例来自2008年9月-2010年3月我院住院或门诊初诊急性髓系白血病患者,男性28例,女性32例,平均年龄38(16-76)岁,其中M13例,M222例,M318例,M47例,M510例,正常对照为6名骨髓移植供者。2实验方法2.1 RNA的提取与反转录：Trizol一步法提取总RNA,检测其完整性和浓度,反转录反应使用Fermentas公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit,反应液配制按试剂盒要求操作,反应条件：42℃60min,70℃5min,4℃5min,-20℃保存备用。2.2一致性检测：PCR反应体系：PCR反应液12.5μl, cDNA模板3μl,上下游引物各0.25 u l,灭菌超纯水9μl, PCR反应总体积为25μl,反应条件为：94℃预变性3 min,94°C变性1 min,57℃退火45 sec,72℃延伸1 min的条件下循环35次,72℃延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳(90V,30min)。2.3实时定量PCR扩增：PCR扩增在ABI3700实时荧光定量PCR仪上进行。TAKARA设计合成NF-κB基因引物。上游引物序列为5’CTG AAC CAG GGC ATA CCT GT3’,下游引物序列为5’GAG AAG TCC ATG TCC GCA AT3’,扩增产物197bp,内参GAPDH上游引物序列为5’TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3’,下游引物序列为5’TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3’,扩增产物206bp。PCR反应液购买于TAKARA公司的SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time),反应体系为50 ul。反应条件为：94℃预变性3 min；第二阶段：94°C变性30sec,57℃退火30sec,72℃延伸45sec;40个循环；72℃延伸10min,间隔30s绘制溶解曲线。结果1.琼脂糖凝胶电泳图(见附页)可见各组NF-κB cDNA及内参GAPDH扩增结果,内参扩增条带位于206bp左右,NF-κB扩增条带位于197bp左右。2. NF-κB的Real-time PCR结果：将相当于0.01-100ng总RNA的cDNA作为模板,进行实时PCR扩增,制作标准曲线和溶解曲线。由图可知(见附页),NF-κB, GAPDH扩增曲线中溶解温度90℃和87℃左右,说明PCR扩增产物为单一产物。NF-κB及GAPDH的标准曲线及两者的扩增效率(Ef)基本一致。3. NF-κB mRNA在急性髓系白血病不同亚型中的表达对目的基因和参比基因的CT值进行归一化,即ΔCt=Ct目的-Ct内参,各组NF-κBmRNA表达量以x表示,由表可见实验组NF-κB mRNA表达高于正常对照组(P<0.05),应用方差分析,M4组NF-κB mRNA表达量大于M2组(P<0.05),Ms组大于M1,M2,M3组(P<0.05),余差别无统计学意义。结论1. NF-κB在AML中表达升高,其表达上调在AML发病中可能起了重要作用。2. NF-κB在AML不同亚型中的表达有差别。3.抑制NF-κB的活性有望在分子水平治疗AML