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胞嘧啶核苷三磷酸(简称胞苷三磷酸，CTP)是一种高能磷酸化合物，是嘧啶合成途径中非常重要的终产物。其参与机体细胞膜磷脂，卵磷脂等重要磷脂类化合物的合成代谢，也是合成DNA，RNA等重要物质前体。CTP在实际生活中应用广泛，主要应用于制药工业。其能调节经神经气膜的合成改建，特别是突触内重要成分的新陈代谢，因此具有激活和促进受损神经组织再生和修复的功能，延缓死亡，提高神经细胞抗损伤能力、改善脂肪代谢、缓解血管硬化等作用。传统的CTP生产路线是以胞嘧啶核苷单磷酸(CMP)为底物，由酵母、产氨短杆菌磷酸化后，经离子交换而获得精制的CTP。胞苷三磷酸的合成工艺方法主要包括化学法、生物合成法、光合磷酸法等几种。由于底物价格的原因，国内外对CTP工业化生产的研究甚少，在我国真正生产CTP的企业基本上没有，但自发现可作为药物以后，市场需求却逐年增加。在嘧啶合成途径中，CTP合成酶能以UTP为底物产生CTP，但是CTP有强烈的反馈抑制，其反馈调节天冬氨酸转氨甲酰酶和CTP合成酶。因此，采用野生菌生成CTP能力有限。而增加胞内CTP合成酶的浓度，定向进化等方法，可以大大缓解这种反馈抑制，达到增加产量的目的。 本实验室已经从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中获得一种具有自主知识产权的且酶活较高的胞嘧啶核苷三磷酸合成酶(CTPs)，并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功表达。该胞嘧啶核苷三磷酸合成酶基因(pyrG)包含1665个碱基对，并编码554个氨基酸。经镍柱纯化，成功得到了电泳纯的CTPs，分子量为60.57kDa，经过对酶催化条件优化，结果表明，诱导剂浓度为0.8mM，诱导8h后，在30℃，pH8.0，10mM Mg2+条件下效果最佳，重组大肠杆菌的CTP活力为1.42U/mg。 为了降低产物抑制，本实验通过同源建模以及查阅文献等方法获得CTP与CTP合成酶结合的关键位点。将活性中心的160位谷氨酸突变成天冬氨酸(D160E)，162位天冬氨酸变成丙氨酸(E162A)，168位的天冬氨酸变成赖氨酸(E168K)。在已经构建的pyrG基因基础上，通过设计突变引物引入6个不同位点的突变(D160E、E168K、E162A、D160E-E162A、D160E-E168K、D160E-E162A-E168K)，并将其分别连接至pET28a载体上，成功构建出6个不同原核表达载体后，转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中，得到6个重组表达菌株。对包括未突变基因在内的7种工程菌分别进行诱导表达，表达产物经镍离子亲和层析柱纯化，初步获得纯化目的蛋白。检测7种重组蛋白的产物抑制能力。结果显示，突变重组菌抑制常数均都有所增加。在单点突变中，抑制常数IC50以突变点E162A(162位的Asp突变成Ala)增加最大，增大了约12倍，多点突变中以CTPS-D160E-E162A-E168K的抑制常数增加最大，约23倍。但是，Km及Vmax未发生太大变化。综上所述，本研究成功克隆了6个突变的重组谷氨酸棒杆菌ATCC13032 pyrG基因，经过动力学常数测定，初步获得能大大降低产物抑制的重组蛋白CTPs-D160E-E162A-E168K。 同时，我们对催化工艺进行了初步研究。全细胞催化实验表明，以UTP为直接底物时，催化5h后，突变体Rosetta-pyrG-D160E-E162A-E168K催化产生的CTP积累量达到0.2g/L，而Rosetta-pyrG-wild为0.02g/L，积累量增加了10倍，大大降低了产物抑制。当以乳清酸为底物进行发酵实验时，48h后，突变株Rosetta-pyrG-D160E-E162A-E168K发酵液中CTP积累量达到0.04g/L，而野生型菌株只有0.02g/L，这是因为，在嘧啶合成途径中，还有其他限速步骤，如PRPP，UMP等都为反馈抑制比较强烈的物质。